La stimolazione cerebrale Slice Utilizzando una rete Microfluidic e della Camera di perfusione standard

L'obiettivo principale del progetto che vi mostreremo oggi è quello di poter controllare in modo spaziale e temporale la stimolazione cerebrale. Un altro punto fondamentale è che, grazie a una semplice modifica dell'ormai complesso apparato elettrofisiologico, possiamo diffondere questo dispositivo microfluidico tra i vari laboratori che utilizzano effettivamente questa stimolazione cerebrale in condizioni vitali. Salve, sono Java Chek Mohammad del laboratorio Edington del Dipartimento di Bioingegneria dell'Università dell'Illinois a Chicago.

Oggi vi mostrerò come applicare un semplice dispositivo microfluidico microfabbricato per la stimolazione di fette cerebrali. Il dispositivo per fette cerebrali che andremo a dimostrare oggi è molto utile per diversi motivi, e i motivi principali sono la sua modularità, che permette di integrarlo facilmente in un setup elettrofisiologico esistente senza ulteriori modifiche, e il fatto che evita l'uso di tubicini e pompe, elementi che complicano qualsiasi dispositivo microfluidico.

E poiché stiamo utilizzando il metodo di pompaggio passivo, non abbiamo bisogno di tubi né di pompe. E la terza cosa è che si tratta semplicemente di un sottile foglio di membrana in PDMS che viene inserito tra una lamella e una camera di perfusione standard, utilizzata in un normale setup di elettrofisiologia. La procedura che dimostrerò oggi inizia con un master C eight, realizzato mediante il processo standard di litografia SV eight.

E il master che abbiamo oggi qui è un master a due livelli, in cui un livello presenta il disegno dei canali, i microcanali, e un altro disegno per le aperture VR che vanno posizionate sopra questi canali in modo che le soluzioni che scorrono attraverso i canali possano fuoriuscire attraverso le aperture via. Realizziamo quindi questo master, che si trova su una wafer di silicone, e successivamente utilizziamo il silicone o il PDMS versandolo sulla superficie di questo dispositivo per riprodurre in calco le strutture presenti sulla wafer nel PDMS. Dunque, verseremo il PDMS sulla superficie di questo dispositivo.

Quindi prenderemo la membrana in PDMS formata dopo la polimerizzazione e legata a un vetrino. A questo punto avremo il nostro dispositivo microfluidico. Successivamente modificheremo una camera di perfusione standard rivestendo il fondo della camera con uno strato sottile di PDMS.

E una volta ottenuta questa camera di perfusione modificata, prenderemo il dispositivo microfluidico che abbiamo realizzato in precedenza e lo fisseremo alla camera di perfusione. Vi sono due punti critici nella fabbricazione del dispositivo microfluidico. Il primo è che, prima di versare il PDMS, la piastra riscaldante deve essere spenta, in modo che il PDMS non polimerizzi immediatamente quando viene versato sul wafer.

Un altro punto critico riguarda gli spaziatori che utilizziamo ai quattro angoli della piastrina di silicio, che devono avere un'altezza inferiore rispetto alla struttura più alta presente sulla piastrina. Questo è necessario per assicurare che le aperture del VR possano essere ottenute durante il processo di reticolazione del PDMS. Ci troviamo qui all'interno di questa camera bianca modulare e questa è la matrice che abbiamo realizzato utilizzando un processo standard di litografia a C otto.

Si tratta di un master a due livelli, in cui il primo livello presenta la progettazione dei canali con quattro ingressi e un'uscita. Nella regione centrale di tutti e quattro i canali sono presenti dei via o pos posizionati sulla sommità dei canali stessi. Questi costituiscono i segni di allineamento creati durante il processo di fabbricazione.

Ora vi mostrerò come rimuoverlo ed eseguire la reticolazione del PDMS. A causa dell'effetto del bordo periferico, lo spessore nella parte esterna della wafer è maggiore rispetto a quello dei dispositivi effettivi situati al centro della wafer. Quindi, rimuoveremo questi segni di allineamento utilizzando la lama riservata e, per alloggiare i pesi, useremo questi distanziali alti 140 micron posizionandoli ai quattro angoli della wafer.

Pertanto, è necessario assicurarsi che la lametta non si avvicini troppo ai dispositivi reali. Ora rimuoverò le particelle SVA utilizzando l'aria compressa e la wafer è ora pronta per la preparazione del mold in PDMS. Ma prima di farlo, dobbiamo posizionare questi spessori alti 140 micron.

Posizionerò quindi i quattro pezzi di nastro ai quattro angoli della piastrina. Poi verificherò che il nastro aderisca correttamente alla piastrina. Il motivo per cui il nastro ha un'altezza di 140 micron è che il master a due livelli, comprendente i canali e il VS, è alto 150 micron.

E quando posizioniamo il peso sulla parte superiore del PDMS durante la polimerizzazione del PDMS, dobbiamo assicurarci che il foglio di PDMS risulti piatto. Utilizziamo quindi quattro distanziali agli angoli, tutti della stessa altezza. Ora mostrerò come procediamo per incunare il PDMS e polimerizzarlo al fine di realizzare i dispositivi.

Ma prima di farlo, lasciatemi mostrare come abbiamo preparato la soluzione di PDMS. Prendiamo 10 parti di base e una parte di agente indurente, mescolando accuratamente a causa del processo di miscelazione. Si osserva che generiamo molte bolle nella soluzione di PDMS; per rimuovere queste bolle, metteremo il PDMS nel desiccante. Dopo aver inserito il PDMS nel desiccante per 10 minuti, non ci sono più bolle.

Ora il PDMS è pronto per essere utilizzato nella polimerizzazione. Ora vi mostrerò come applichiamo il PDMS sulla wafer e lo polimerizziamo per ottenere la membrana di PDMS. Quindi, applicherò il PDMS sulla wafer e poi userò questa pellicola trasparente per coprire il PDMS.

E questo ci aiuterà a rimuovere il dispositivo sup, separare il dispositivo dalla pellicola trasparente e poi posizionerò i pesi sopra la pellicola. Il motivo per cui utilizziamo i pesi è ottenere uno spessore uniforme del PDMS. Un altro aspetto fondamentale è ottenere aperture per i via.

Quindi, ogni volta che ci sono delle vs, non vogliamo PDMS e i pesetti ci aiuteranno a ottenere questo risultato. Come potete vedere qui, la piastra riscaldante è spenta e il motivo è che non vogliamo che il PDMS si polimerizzi immediatamente, quindi la lasciamo spenta. Successivamente, è necessario assicurarsi che la wafer sia piatta prima di trasferire il PDMS.

E ora possiamo trasferire il PDMS che abbiamo preparato in precedenza. Assicurarsi di dispensare il PDMS abbastanza vicino alla wafer in modo da non generare bolle. E il punto più critico qui è il modo in cui si posiziona la trasparenza sopra il PDMS.

È necessario assicurarsi di non generare bolle a causa del posizionamento del foglio. Ora posizionerò uno di questi laboratori in vetro e lascerò fuoriuscire l'eccesso di PDMS. Sto posizionando altri tre laboratori in vetro e mi accerto che i laboratori in vetro non si spostino rispetto a questo particolare stampo.

E per queste caratteristiche specifiche, abbiamo scoperto che posizionare questi quattro distanziatori di vetro rende possibile il corretto allineamento del VS e permette all'eccesso di PDMS di fuoriuscire dallo spazio tra la pellicola trasparente e la piastrina. Attendiamo da uno a due minuti, dopodiché possiamo avviare la piastra riscaldante. Per diversi stampi e progetti differenti, potrebbe essere necessario aumentare o ridurre il numero di distanziatori di vetro al fine di ottenere aperture via. Ora la piastra riscaldante è pronta per essere accesa e imposterò una temperatura di 75 gradi.

E una volta raggiunta la temperatura di 75 gradi, possiamo impostare il timer per un'ora e lasciare polimerizzare il PDMS. Ora che abbiamo lasciato polimerizzare il PDMS per un'ora, possiamo spegnere la piastra riscaldante e lasciarla raffreddare fino a 50 gradi centigradi. Il motivo per cui si fa ciò è evitare che il SEA si incrina.

Se lo rimuoviamo immediatamente da 75 gradi alla temperatura ambiente, ora possiamo spegnerlo e attendere che si raffreddi fino a 50 gradi centigradi. Ora che la temperatura della piastra riscaldante è scesa a 50 gradi centigradi, possiamo rimuovere i pesi dalla trasparenza. Ora possiamo rimuovere la wafer dalla piastra riscaldante ed è pronta per essere tagliata.

Ora il foglio di PDMS è pronto per essere rimosso dal master in a C eight e dobbiamo rimuovere la pellicola di alluminio. Successivamente dobbiamo rimuovere il foglio trasparente. Abbiamo qui la camera di perfusione standard.

L'abbiamo modificato in modo da poterlo allineare. I fori, le porte di ingresso e di uscita del dispositivo microfluidico. Quindi queste sono le quattro porte di ingresso e una porta di uscita sulla membrana in PDMS.

E questi devono corrispondere ai quattro ingressi e all'uscita sulla camera di perfusione. Ora inserirò la camera di perfusione e la allineerò con i fori sulla membrana in PDMS. Ora che sono allineati, è pronta per essere tagliata.

Ora è possibile rimuovere la camera utilizzando una sonda. Assicurarsi che tutti i bordi della membrana in PDMS siano liberi per essere rimossi. Una volta fatto ciò, si può utilizzare un congelatore per rimuovere la membrana in PDMS e assicurarsi, quando si stacca il PDMS dalla parte superiore del dispositivo, di muovere il PDMS molto lentamente in modo da non strappare la membrana in PDMS.

Ora posizionerò la membrana in PDMS con le cavità formate utilizzando gli stampi SC otto sulla parte superiore, assicurandomi che sia piatta. La ragione per cui facciamo ciò è garantire che, quando realizzeremo i fori dei canali di ingresso e di uscita, il PDMS non risulti ruvido sul lato che verrà poi legato al vetrino coprioggetto.

Quindi dobbiamo assicurarci che le cavità siano sul lato superiore. Ora possiamo realizzare i fori di ingresso e di uscita in modo da poter vedere chiaramente i buchi. Mettiamo uno sfondo nero.

Ora procederò a creare i porti di ingresso e di uscita, assicurandomi che non rimanga alcun PDMS nel porto. Quindi, rimuoviamo ogni traccia di PDMS. Ora trasferiremo la membrana in PDMS su un altro foglio trasparente.

Quindi possiamo trattare la lamina e il coverslip al plasma e posizionarli in modo che le cavità si trovino ancora sulla parte superiore. Una volta che questa superficie è stata trattata al plasma e il coverslip è stato a sua volta trattato al plasma, possiamo unire queste due superfici per formare la rete microfluidica, rimuovendo le bolle d'aria tra il foglio di PDMS. Per la trasparenza, si può utilizzare del nastro adesivo.

In questo modo si garantisce che il foglio di PDMS sia piatto e che l'adesione avvenga in modo molto migliore. Quindi, utilizzare nuovamente il nastro adesivo sulla superficie superiore per rimuovere eventuali polveri dalla membrana di PDMS. Ora possiamo posizionare il vetrino che uniremo alla membrana di PDMS.

Ora questi due pezzi di PDMS e il vetro sono pronti per il trattamento al plasma. Tratteremo al plasma il PDMS e il vetrino coprioggetto utilizzando questo sistema a plasma modificato a microonde, dove si può vedere che la camera di vetro ci permette di generare il plasma all'interno del microonde. Lasciatemi posizionare i campioni all'interno, creando il vuoto nella camera.

Ora posso far fluire l'ossigeno. Ora il sistema al plasma è pronto e utilizzerò una potenza del 10% per 10 secondi in questo sistema specifico per aiutare a visualizzare il plasma. Mentre il trattamento al plasma è in corso, abbiamo aumentato la potenza al cento per cento e spento le luci.

E ora puoi vedere il plasma immediatamente dopo il trattamento al plasma. È necessario incollare entrambe le superfici, il vetrino di mucca e il PDMS, altrimenti la superficie del PDMS perderà la sua idrofilicità a causa del trattamento al plasma. Una volta posizionato il vetrino di mucca, assicurati che l'intera superficie sia unita senza bolle d'aria.

Se sono presenti bolle d'aria, è possibile rimuoverle. Ora mettetelo da parte per cinque minuti e lasciate che avvenga il legame. Qui abbiamo la camera di perfusione modificata, nella quale abbiamo modificato la base della camera con PDMS.

E questo è stato fatto in precedenza. Quindi abbiamo posizionato una pellicola trasparente su una piastra riscaldante spenta. Successivamente abbiamo versato il P-D-M-S-P-D-M-S preparato in modo analogo a quanto mostrato in precedenza.

Quindi abbiamo posizionato la camera di perfusione sopra il PDMS e abbiamo aggiunto un singolo peso come mostrato qui, lasciando polimerizzare per 30 minuti a 75 gradi centigradi. Ora, mentre aspettiamo che avvenga il legame tra il PDMS e il coverslip, possiamo procedere con la preparazione della camera. Quindi possiamo procedere a saldare la camera e il dispositivo microfluidico.

Pertanto, dobbiamo rimuovere l'eccesso di PDMS da tutte le aree in cui non è necessario. Rimuovere prima la pellicola trasparente e poi il PDMS. Successivamente, è necessario eliminare il PDMS dalle porte di ingresso e di uscita. Ora la camera è pronta per essere sigillata con il dispositivo microfluidico che abbiamo preparato in precedenza.

Ora che abbiamo atteso cinque minuti, il dispositivo microfluidico è pronto per essere separato dalla trasparenza, ma è necessario assicurarsi di rimuovere la trasparenza a una velocità lenta, in modo che il PDMS e il vetrino non si separino. Ora che la camera di perfusione è pronta, dobbiamo sottoporre a trattamento al plasma la superficie inferiore della camera, dove abbiamo appena incollato il PDMS, e la superficie superiore del dispositivo microfluidico che presenta il PDMS.

Ora inseriremo entrambi i pezzi nella camera al plasma ed eseguiremo il trattamento al plasma al 10% di potenza per 10 secondi. Ora entrambe le superfici sono state trattate con il plasma e sono pronte per essere saldate. Prima di procedere alla saldatura, è necessario verificare che i porti di ingresso e di uscita sulla camera siano allineati con il dispositivo microfluidico.

E poiché le caratteristiche che stiamo allineando sono sufficientemente grandi, non abbiamo bisogno di attrezzature speciali e possiamo farlo a occhio nudo. Una volta allineato e posizionato sopra la camera, assicurarsi che tutte le superfici siano a contatto, quindi lasciare riposare per cinque minuti. In questo modo, l'adesione sarà sufficientemente solida per gli esperimenti dopo aver atteso cinque minuti.

Ora che il dispositivo microfluidico si è legato alla camera, procederemo a rendere idrofili i canali sulla superficie dei canali. In questo modo, quando effettivamente farremo fluire una soluzione di A CFS o qualsiasi altro neurotrasmettitore, le soluzioni potranno scorrere più facilmente. Quindi, inserirò l'intero dispositivo nel plasma e lo sottoporrò a trattamento al plasma per un minuto al 10%, in modo che tutte le superfici interne dei canali diventino idrofili.

E poi lo riempirò d'acqua e lo porterò all'apparato di elettrofisiologia per poter eseguire gli esperimenti veri e propri. Ok, ora siamo pronti per andare all'apparato di elettrofisiologia e utilizzare effettivamente questo dispositivo con la sezione di tessuto cerebrale. Salve, mi chiamo uo.

Sto lavorando con il dottor Arrington e il dottor Fall, del Dipartimento di Bioingegneria dell'Università dell'Illinois. E ora andrò a lavorare con il dispositivo micro-free che ho portato e appena posizionato su questa piattaforma. Da un lato, possiamo vedere il tubo di perfusione.

Dall'altro lato, possiamo vedere il tubo di aspirazione. Il dispositivo verrà quindi perfuso con una soluzione di liquido cerebrospinale, saturata con il 95% di ossigeno e il 5% di CO2. Ora che il microdispositivo V è pronto, preleverò il tessuto cerebrale per poi posizionarlo sopra il microdispositivo.

Ora posizionerò la sezione cerebrale, ehm, sopra le aperture circolari, e poi userò l'ancora per immobilizzare la sezione cerebrale. Ora che la sezione cerebrale è stata immobilizzata, userò, ehm, neurotrasmettitori per stimolarla. Qui abbiamo quattro ingressi, quindi introdurrò neurotrasmettitori in ciascun ingresso sfruttando il pompaggio passivo proveniente da questi quattro ingressi fino a questo scarico.

E ora il dottor Fall parlerà di questo dispositivo. Cosa c'è di così importante per noi? Ciao, sono Chris Fall e ci occupiamo di fisiologia cerebrale.

Il motivo per cui dobbiamo utilizzare fette cerebrali è per ottenere accesso mediante microelettrodi e tecnologie di imaging. Fino ad ora, l'unico modo per modificare l'ambiente di neurotrasmettitori di queste fette cerebrali era quello di variare il flusso sull'intera fetta oppure di somministrare neurotrasmettitori direttamente tramite una micropipetta molto piccola. Siamo quindi molto entusiasti di collaborare con il gruppo di Eddington.

Questa nuova tecnologia ci permetterà di intervenire su vaste aree del cervello e di modificare localmente l'ambiente dei neurotrasmettitori. E poi, simultaneamente, potremo utilizzare i nostri elettrodi e la nostra tecnologia di imaging e, forse in futuro, integrare dispositivi di registrazione multielettrodo nello stesso sistema. Ok, qui vedete una sezione di tessuto cerebrale di topo inserita nel dispositivo microfluidico.

E si può notare anche ad occhio che il cervello è composto da molte regioni diverse. Queste regioni svolgono funzioni differenti. E nell'animale vivo, queste diverse regioni del cervello avrebbero toni neuromodulatori e di neurotrasmettitori differenti.

E vogliamo essere in grado di replicare questo nel nostro camera per sezioni mentre effettuiamo registrazioni elettrofisiologiche e di imaging. È quindi estremamente utile poter stimolare queste diverse aree con diversi neurotrasmettitori, a concentrazioni diverse e con diversi andamenti temporali. E sebbene non possiamo realmente visualizzare i neurotrasmettitori, possiamo mostrarvi qui un esempio di un colorante fluorescente che viene pompato nella sezione cerebrale in diverse regioni.

Qui vedete un filmato in cui stiamo facendo fluire un colorante fluorescente attraverso i canali del dispositivo, visualizzandone l'uscita dai pori realizzati. Anche in questo prototipo iniziale, si può notare quanto sia precisa la risoluzione spaziale del flusso. Osservando il filmato, vedrete il colorante fluire nei canali e poi fuoriuscire dai fori, per poi essere rimosso mediante lavaggio, mostrando così anche la risoluzione temporale del flusso.

Grazie per aver partecipato oggi. Credo che siamo riusciti a dimostrare come la microfluidica e, in effetti, le micro-macchine possano essere integrate con tecniche fisiologiche tradizionali per aiutarci a comprendere il funzionamento del cervello. Grazie.