Un metodo di localizzazione in immunofluorescenza in vivo per studiare la biodistribuzione degli anticorpi

Prendiamo un modello murino di cancro al seno. I tumori della ghiandola mammaria comprendono cellule tumorali, fibroblasti associati al cancro, adipociti, cellule immunitarie e vascolarizzazione tumorale.

Iniettare per via endovenosa anticorpi specifici per il tumore coniugati con fluorofori.

Dopo aver raggiunto il sistema vascolare tumorale, gli anticorpi si legano alle proteine transmembrana specifiche del tumore sull'endotelio del vaso e sulle cellule tumorali vicine.

Isolare chirurgicamente la ghiandola mammaria e immergerla in un mezzo di congelamento.

Ottenere le criosezioni su un vetrino e risciacquare con un tampone per rimuovere il mezzo di congelamento.

Fissare le sezioni per preservare l'architettura dei tessuti. Applicare un detergente per migliorare l'immunocolorazione e una soluzione bloccante per prevenire il legame di anticorpi non specifici.

Introdurre un anticorpo primario specifico per le molecole di adesione sull'endotelio dei vasi sanguigni e un anticorpo secondario coniugato con fluorofori che si lega all'anticorpo primario, marcando il sistema vascolare.

Aggiungere un mezzo di montaggio sul vetrino e posizionare un vetrino coprioggetti.

Al microscopio confocale, valutare la biodistribuzione degli anticorpi specifici del tumore all'interno e intorno al sistema vascolare tumorale marcato in fluorescenza.

Dopo l'anestesia come descritto nel protocollo di testo, prepararsi per l'inoculazione della vena caudale delle soluzioni anticorpali. Disinfettare la coda dell'animale strofinando tre volte con una salvietta imbevuta di alcol. Dilatare le vene della coda scaldandole con un termoforo per circa 30 secondi; Evitare di riscaldare l'intero animale. Utilizzando un catetere a palette di coda calibro 27, inserire l'ago a farfalla in una delle due vene laterali della coda.

Visualizzare il riflusso del sangue nel catetere per assicurarsi che l'ago sia posizionato correttamente in modo che le soluzioni entrino completamente nell'animale invece di essere catturate nella coda.

Utilizzare un pezzo di nastro chirurgico per fissare con cura la coda con l'ago inserito al tavolino. Lavare il catetere con 25 microlitri di soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato. Quindi, iniettare la soluzione di anticorpi nel catetere utilizzando siringhe da insulina. Lavare nuovamente il catetere con 25 microlitri di PBS sterile. Rimuovi l'ago dalla coda e applica pressione per fermare l'emorragia.

Eseguire l'eutanasia umana del topo, come descritto nel protocollo di testo, e adagiare il topo in posizione supina. Usa forbici e pinze chirurgiche per asportare i tessuti tumorali. Usa il forcipe per afferrare solo lo strato esterno di pelle tra l'insieme di ghiandole mammarie più vicine alla coda e per fare una piccola incisione con un paio di forbici chirurgiche. Introdurre le forbici chiuse nel taglio, e aprire lentamente la punta per separare accuratamente la pelle dalla sottostante membrana della parete addominale, mantenendola intatta.

Praticare un'incisione verticale lungo l'addome, continuando a separare la pelle dalla membrana interna. Tra la terza e la quarta ghiandola mammaria, praticare un taglio orizzontale attraverso l'addome, per consentire la retrazione della pelle e la visualizzazione delle ghiandole mammarie. Afferrando ogni tumore o ghiandola normale con una pinza, tagliare accuratamente la pelle attaccata usando le forbici chirurgiche.

Posizionare i tessuti asportati in stampi di base monouso in tessuto pre-etichettati e riempiti con mezzo di inclusione a temperatura di taglio ottimale. Congelare rapidamente gli stampini posizionandoli su ghiaccio secco. Al fine di studiare la consegna fuori bersaglio, asportare altri tessuti o organi di interesse. Utilizzando un criostato, sezionare blocchi di tessuto congelato a uno spessore di 10 micron e posizionare le sezioni adiacenti su vetrini di adesione pre-marcati.

Sciacquare i vetrini di tessuto congelati con PBS a temperatura ambiente per 5 minuti per rimuovere il mezzo di inclusione. Delimitare le sezioni di tessuto con una penna barriera idrofobica per ridurre il volume delle soluzioni necessarie durante la colorazione. Fissare le sezioni di tessuto con una soluzione di paraformaldeide al 4% per 5 minuti. Dopo aver risciacquato i vetrini in PBS per 5 minuti, permeabilizzare le sezioni di tessuto con Triton X-100 allo 0,5% in PBS per 15 minuti. Sciacquare nuovamente i vetrini in PBS per 5 minuti.

Bloccare i tessuti con PBS contenente il 3% in peso per volume di albumina sierica bovina e il 5% in volume per volume di siero di capra per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo aver risciacquato i vetrini in PBS per 5 minuti, incubare le sezioni con anticorpi primari che conservano la registrazione, come un comune marcatore nucleare, vascolare o citoplasmatico. Qui, il CD31 anti-topo per ratti viene utilizzato a una diluizione da 1 a 100 nella soluzione bloccante. I vetrini con anticorpi primari vengono lasciati per una notte a 4 gradi Celsius, protetti dalla disidratazione su un vassoio per vetrini.

Dopo l'incubazione, sciacquare i vetrini in PBS per 5 minuti tre volte. Cambia il PBS ogni volta. Incubare i vetrini con anticorpi secondari per marcare gli anticorpi primari. Per questa applicazione, visualizzare l'anticorpo anti-B7-H3 utilizzando l'anticorpo anti-coniglio di capra coniugato AlexaFluor-546 e visualizzare CD31 con l'anticorpo secondario anti-ratto di capra AlexaFluor-488 in soluzione bloccante. Proteggere i vetrini dalla luce e dalla disidratazione su un vassoio per vetrini per 1 ora a temperatura ambiente.

Dopo aver risciacquato i vetrini in PBS, come prima, applicare una goccia del mezzo di montaggio al centro della fetta di tessuto. Posizionare con cura un vetrino coprioggetti evitando l'intrappolamento di bolle d'aria. Sigillare i bordi del vetrino coprioggetto con smalto trasparente e lasciare asciugare. Procedere con l'imaging al microscopio confocale e l'analisi quantitativa delle immagini, come descritto nel protocollo di testo.