Monitoraggio Deformazioni tessuto morfogenetica in embrione di pollo primi

L'obiettivo generale delle tecniche qui presentate è etichettare e coltivare tessuti embrionali al fine di misurare le deformazioni morfogenetiche durante lo sviluppo iniziale. Per la coltura dell'embrione di pollo nelle prime fasi, iniziare rimuovendo l'embrione dall'uovo mediante il metodo del supporto in carta da filtro. A seconda dell'applicazione sperimentale, etichettare l'embrione estratto con coloranti fluorescenti lipofilici somministrati tramite particelle di ferro magnetiche o con microsfere di polistirene. Successivamente, seguire nel tempo le etichette durante la coltura utilizzando microscopia a fluorescenza o imaging mediante tomografia a coerenza ottica.

Le mappe di deformazione morfogenetica risultanti dall'imaging indicano regioni di allungamento, accorciamento e scorrimento del tessuto sia in due che in tre dimensioni. Ciao, mi chiamo Ben Philis e sono uno studente laureato nel laboratorio del Dott. Larry Tabor del Dipartimento di Ingegneria Biomedica della Washington University di St. Louis. Prima di iniziare questo tipo di esperimenti, è importante considerare le tecniche di coltura cellulare pertinenti al vostro sistema modello, le modalità di imaging a cui potreste avere accesso e anche il tipo di dati che desiderate ottenere dai vostri esperimenti.

Ad esempio, siete interessati all'analisi delle deformazioni dei tessuti in due o tre dimensioni? Affrontiamo alcune di queste domande oggi mostrando due tecniche di marcatura complementari nell'embrione precoce di pollo. Ciao, mi chiamo Victor Varner e lavoro nel laboratorio del Dottor Larry Tabor presso l'Università di Washington a St. Louis.

In entrambe queste tecniche, etichettiamo rapidamente e simultaneamente centinaia di cellule nell'embrione precoce di pollo. Seguendo il movimento di queste etichette, possiamo non solo determinare i tessuti in cui queste cellule alla fine si stabiliscono, ma anche quantificare le deformazioni a livello tessutale che modellano l'embrione precoce. Innanzitutto, incubare le uova in orientamento longitudinale fino allo stadio desiderato, come definito da Hamburger e Hamilton.

Rompere la base dell'uovo sul bordo di una piastra di Petri da 150 millimetri. Aprire il guscio dalla parte inferiore, versare il contenuto dell'uovo nella piastra ed eliminare, con pinzette a punta smussata, l'albume più spesso e viscoso dal tuorlo. A questo punto, praticare dei fori al centro di un filtro di carta circolare.

Posizionare uno degli anelli di carta da filtro sul tuorlo in modo che l'embrione sia visibile attraverso il foro centrale dell'anello. Tagliare lungo il perimetro esterno dell'anello di carta da filtro con forbici microchirurgiche. Successivamente, rimuovere la carta con l'embrione attaccato dal tuorlo utilizzando pinzette fini e immergere delicatamente l'embrione in un bagno di PBS. Per rimuovere le particelle di tuorlo aderenti, trasferire l'insieme della carta da filtro in una piastra di coltura da 35 millimetri.

Posizionandolo con il lato ventrale rivolto verso l'alto, trasferire l'embrione con un secondo anello di carta filtro. Fissarlo con un anello metallico e immergere l'embrione nel mezzo di coltura. Se l'embrione non è completamente immerso, la geometria del tessuto e la successiva morfogenesi possono essere notevolmente alterate da carichi anomali di tensione superficiale.

Durante la coltura, utilizzando un microscopio a campo chiaro, verificare la morfologia corretta e lo stadio embrionale. Prelevare innanzitutto una piccola quantità di polvere di ferro, aggiungere alcune gocce di colorante saturo e alcol, quindi essiccare all'aria con la punta di una micropipetta allungata. Separare le particelle di ferro aggregate e trasferirle in una provetta per microcentrifuga.

Dopo diversi risciacqui effettuati in posizione coperta con acqua ionizzata, posizionare l'embrione raccolto con la faccia dorsale rivolta verso l'alto in una piastra di coltura da 35 millimetri ricoperta da uno strato abbondante di mezzo di coltura. Sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare l'ago di vetro per rimuovere la membrana vilina ed esporre le cellule ectodermiche. A questo punto, aspirare una colonna di particelle di ferro marcate in una pipetta di vetro.

Utilizzando il microscopio stereoscopico, immergere la pipetta posizionandola appena sopra l'embrione. Ruotare lentamente la pipetta avanti e indietro tra le dita per spargere le particelle sull'embrione. Dopo un'incubazione di 10 minuti a 37 gradi Celsius, rimuovere le particelle utilizzando un magnete potente.

Se necessario, fissare l'ago magnetico a una pinzetta magnetica fine e utilizzare la pinzetta magnetizzata per rimuovere con attenzione eventuali particelle residue di ferro. Procedere quindi ad acquisire sia immagini in campo chiaro che immagini fluorescenti dell'embrione. Con un ago da 22 gauge.

Aspirare una soluzione di microsfere nere con diametro di 10 micrometri in PBS in una siringa da 10 cc. Quindi arrotondare le punte degli aghi di vetro utilizzando un disco rigido di computer e riempirli con la soluzione di perline. Dare un leggero colpetto alla micropipetta affinché la soluzione raggiunga la punta, utilizzando un micromanipolatore.

Posizionare l'ago di vetro nello stesso campo visivo dell'embrione. Verificare il flusso delle perline fuori dalla punta della pipetta. Inserire ora la punta della pipetta nella cavità del tubo neurale.

Avendo cura di non perforare il pavimento ventrale del tessuto. Osservare il rigonfiamento transitorio del tessuto man mano che le perle e il liquido entrano nella cavità luminale. Rimuovere quindi rapidamente l'ago di vetro.

Infine, verificare una densità sufficiente di perline nella cavità interna del tubo neurale. Utilizzando un microscopio a campo chiaro, lasciare sedimentare le perline per 20-30 minuti prima di acquisire immagini a campo chiaro o un dataset di tomografia a coerenza ottica. Dopo aver acquisito le prime immagini, posizionare fino a 7 piatti di coltura da 35 millimetri con i campioni all'interno di una capsula di Petri da 150 millimetri e inserire l'intero assemblaggio in un sacchetto di plastica piccolo.

Aggiungere gocce di acqua deionizzata nel sacchetto per l'umidificazione, quindi riempire il sacchetto con una miscela di 95% ossigeno e 5% anidride carbonica. Posizionare gli embrioni in un incubatore a 37 gradi Celsius fino al successivo punto temporale di acquisizione delle immagini. Posizionare gli embrioni etichettati in una piastra delta T contenente 1,2 millilitri di mezzo di coltura e coprire la piastra con un coperchio di vetro mantenuto a 37 gradi Celsius. Superfondere l'embrione con una miscela gassosa 95% O₂ e 5% CO₂ fornita da un dispositivo miniaturizzato con flusso variabile. Impostare ora il software per acquisire automaticamente le immagini agli intervalli di tempo desiderati.

Nel corso dell'esperimento, le etichette possono essere tracciate automaticamente o manualmente, e possono essere calcolate mappe della deformazione morfogenetica per le coordinate dei marcatori. Qui, la tecnica delle particelle di ferro è stata utilizzata per etichettare e tracciare il movimento delle cellule elettrodermiche durante la formazione del solco cefalico. Nell'embrione di pollo in fase iniziale, le cellule marcate con fluorescenza erano distribuite in tutto l'embrione.

Sono state acquisite immagini in campo chiaro e immagini fluorescenti dell'embrione a intervalli diversi durante la coltura ex ovo. Per monitorare i movimenti delle etichette del tratto. I dati cumulativi permettono il calcolo delle distribuzioni di deformazione morfogenetica in evoluzione durante la formazione del solco cefalico.

Allo stesso modo, la tecnica delle microsfere di polistirene è stata utilizzata per tracciare i movimenti dei tessuti al confine tra metencefalo e romboencefalo nel cervello del pulcino in fase iniziale. Si noti che questo metodo è in grado di gestire deformazioni distintamente tridimensionali, poiché le perline tendono ad aderire a tutti i lati della parete interna del lume cerebrale. Dopo aver tracciato il movimento delle perline per sei ore, le coordinate dei marcatori permettono di calcolare le deformazioni, caratterizzando la deformazione del tessuto nelle direzioni longitudinale e circonferenziale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una chiara idea di alcuni passaggi sperimentali necessari per realizzare la tua coltura tissutale e la relativa marcatura. Le tecniche di protocollo presentate qui sono particolarmente vantaggiose perché risultano minimamente invasive per i tessuti nativi e richiedono materiali a basso costo e facilmente reperibili. Questi esperimenti sono particolarmente utili per studi sulle meccaniche dello sviluppo embrionale.

Dato che i campi di deformazione calcolati utilizzando il movimento tracciato di cellule marcate possono essere impiegati sia per verificare che per costruire modelli fisici della morfogenesi.