Dissezione Host-virus Interazione in replica litico di un Herpesvirus modello

L'obiettivo generale del seguente esperimento è utilizzare diverse approcci virologici e biochimici per analizzare il ruolo di una via di segnalazione dell'ospite nella replicazione litica di un virus erpetico modello. In questo caso, ad esempio, esaminiamo il ruolo della proteina mitocondriale di segnalazione antivirale Mavs durante l'infezione con il virus erpetico gamma HV 68. Per prima cosa, al fine di esaminare il ruolo di Mavs durante l'infezione acuta, topi di tipo selvaggio e topi knock-out per Mavs vengono infettati con gamma HV 68 a seguito di un'infezione virale acuta.

Il polmone del topo viene raccolto e i carichi virali vengono determinati mediante un saggio di placche in cui i campioni vengono diluiti in modo seriale e seminati. Su monostrati, il numero di placche viene quindi contato. Un aumento dei carichi virali nei topi knock-out suggerisce che il gene di interesse svolge un ruolo antivirale.

Al contrario, la riduzione del carico virale nei topi knock-out indica che il gene è necessario per l'infezione virale. Per convalidare questi risultati, vengono esaminate le cinetiche di crescita virale in vitro in fibroblasti embrionali di topo: fibroblasti embrionali di topo di tipo selvaggio e fibroblasti embrionali di topo knock-out per mavs vengono infettati con gamma HV 68 e incubati per diversi periodi di tempo. Le cellule vengono quindi raccolte e vengono eseguiti saggi di formazione di placche per confrontare le cinetiche di crescita multi-step tra cellule di tipo selvaggio e cellule carenti di mavs.

Per validare ulteriormente questi risultati, cellule di fibroblasti embrionali di topo di tipo selvaggio e knockout per mavs vengono infettate con il virus gamma HV 68. Successivamente, il DNA e l'RNA vengono estratti separatamente dalle cellule infette e i trascritti genomici virali vengono analizzati mediante PCR in tempo reale. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo protocollo quando abbiamo studiato il ruolo di una via immunitaria dell'ospite durante un'infezione litica virale.

Questo protocollo potrebbe essere potenzialmente applicato per studiare le regole delle vie di segnalazione dell'ospite durante l'infezione da altri patogeni. Iniziare la procedura permettendo a topi di sesso corrispondente, appartenenti alla stessa nidiata e di età compresa tra le sei e le otto settimane, di ambientarsi per un periodo di quattro giorni dopo il trasporto. Il seguente esperimento verrà eseguito in una struttura per rischi biologici.

Come preparazione, indossare dispositivi di protezione individuale, tra cui camice da laboratorio, guanti, mascherina e copriscarpe, operando all'interno di un armadio a sicurezza biologica di livello due. Preparare la sospensione virale con 40-10.000 PFU di gamma HV 68 e 30 microlitri di PBS sterile per ogni topo da infettare.

Mantenere la sospensione virale sul ghiaccio dopo un'iniezione intraperitoneale di chetamina e xilazina. Verificare che i topi siano stati sedati eseguendo una pinzatura del dito del piede. Quindi, utilizzando una pipetta, somministrare 30 microlitri della sospensione virale goccia a goccia in una delle due narici, sinistra o destra.

Posizionare il topo sul fianco per cinque-dieci minuti per facilitare il rilascio del virus nelle vie aeree e nei polmoni. Successivamente, riposizionare i topi nella loro gabbia e monitorarli fino a quando non si saranno completamente ripresi dalla sedazione. Successivamente, il tessuto polmonare viene prelevato dai topi iniettati per preparare un lisato cellulare utile per valutare il titolo virale in diversi giorni successivi all'infezione.

Posizionare i polmoni prelevati da topi sacrificati in provette sterili da 1,5 millilitro con tappo a vite contenenti 500 microlitri di perle di zirconia-silice da 1,0 millimetro su ghiaccio. Se non si procede al passaggio successivo nello stesso giorno, conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius.

In caso contrario, aggiungere un millilitro di DMEM senza siero e freddo. Posizionare il tubo in un omogeneizzatore a perle e premere il pulsante di avvio per omogeneizzare i polmoni per 30 secondi. Per evitare il surriscaldamento del campione, che potrebbe inattivare il virus.

Raffreddare il tubo sul ghiaccio per almeno un minuto dopo 30 secondi di omogeneizzazione. Quindi ripetere questo processo. Successivamente, centrifugare il tessuto omogeneizzato a 16.000 RCF a quattro gradi Celsius per un minuto.

Dopo la centrifugazione, i detriti cellulari si troveranno sul fondo del tubo e i lipidi sulla superficie. Prelevare immediatamente il surnatante come mostrato qui per eseguire un saggio di placca utilizzando un monostrato di NIH 3T3 o BHK-21. Successivamente, eseguire un saggio di placca per determinare il titolo virale presente nel campione, iniziando il saggio di placca con la realizzazione di diluizioni seriali del sopranatante virale.

Prima, utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 270 microlitri di mezzo in una piastra a 96 pozzetti. Lasciare la prima riga vuota. Quindi aggiungere 200 microlitri di sopernatante in ogni pozzetto della prima riga della piastra a 96 pozzetti, in triplice replicato per ogni campione.

Successivamente, trasferire 30 microlitri del campione dalla prima riga alla riga successiva e mescolare. Poi trasferire 30 microlitri della miscela alla riga successiva e mescolare. Ripetere questo passaggio più volte per ottenere diluizioni seriali di ordine decimale.

Successivamente, aggiungere il surnatante virale diluito sul monolayer cellulare. In una piastra a 24 pozzetti, posizionare la piastra in un incubatore e agitare la piastra ogni 30 minuti durante un'incubazione di due ore. Al termine dell'incubazione, rimuovere i detriti cellulari aspirando il surnatante dalla piastra.

Quindi lavare le cellule una volta con mezzo fresco. Dopo il lavaggio, aggiungere alle cellule del mezzo contenente metilcellulosa. Incubare le cellule per quattro-sei giorni.

Trascorsi quattro-sei giorni, utilizzare un microscopio per leggere il numero di placche per ogni campione. Registrare il numero di placche per ogni diluizione.

Quindi calcolare la media e la deviazione standard. I pozzetti contenenti troppo poche o troppe placche non possono essere utilizzati per calcolare con precisione il titolo. Pertanto, per ogni campione, utilizzare un diluizione in cui siano presenti da sette a 70 placche.

Questo campione diluito di 1000 volte presenta una media di 23 placche per pozzetto. Per calcolare il titolo virale nella soluzione non diluita, moltiplicare il fattore di diluizione per il numero di placche e per il numero di microlitri in un millilitro. Successivamente, dividere tale valore per il volume di sopernatante diluito aggiunto per ogni pozzetto.

Quindi, in questo esempio, 1000 moltiplicato per 23 placche moltiplicato per 1000 microlitri per millilitro, diviso per 100 microlitri, equivale a 2,3 per 10 alla quinta unità formanti placca per millilitro. Successivamente, una soluzione virale con un titolo noto viene utilizzata per determinare la cinetica di crescita del gamma HV 68 in fibroblasti embrionali di topo. Si inizia suddividendo cellule di tipo selvaggio e cellule carenti di un gene dell'ospite in una piastra a 24 pozzetti, con 10.000 cellule per pozzetto. Il giorno successivo, sostituire il mezzo in ogni pozzetto con 0,5 millilitri di una sospensione di gamma HV 68 a basso MOI.

Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius e lasciare procedere l'incubazione per due ore. Agitare la piastra ogni 30 minuti dopo l'incubazione. Utilizzare una pipetta per rimuovere la sospensione virale e aggiungere 0,5 millilitri di DMEM completo fresco contenente 8% di siero fetale bovino alle cellule infettate dal virus.

Rimettere le cellule nell'incubatore in diversi giorni successivi all'infezione. Raccogliere il mezzo e le cellule aspirando e dispensando più volte con una pipetta. Trasferirli immediatamente in provette sterili da centrifuga da 1,5 millilitro e congelare le provette a meno 80 gradi Celsius per liberare il gamma HV 68 dai Mets.

Eseguire tre cicli di congelamento e scongelamento. Scongelare le cellule ponendole a 37 gradi Celsius. Successivamente, vortexare e riposizionarle nel congelatore a meno 80 gradi Celsius.

Determinare il titolo virale mediante saggio di placcatura utilizzando un monostrato di NIH 3T3 o BHK-21, come mostrato in precedenza, per esaminare se la replicazione di DNA o RNA è influenzata dalla carenza di geni dell'ospite o di geni virali. Iniziare con le cellule infette a diversi giorni dall'infezione, scartare il soprannatante, risciacquare le cellule con PBS freddo e trattare le cellule con tripsina ghiacciata. Quindi pellettizzare le cellule mediante centrifugazione a 1000 RCF a temperatura ambiente per un minuto; dopo la centrifugazione, scartare il soprannatante e conservare le cellule a meno 80 gradi Celsius.

Estrai il DNA e l'RNA totali, di origine virale e dell'ospite. Quindi centrifuga le colonne spin. Esegui la PCR in tempo reale utilizzando il DNA totale e primer specifici per trascritti virali litici.

Determinare la quantità relativa del genoma intracellulare di gamma HV 68 in riferimento a un gene di controllo dell'ospite, come l'actina beta. Preparare il CDNA con RNA totale e primer oligo DT. Eseguire una PCR in tempo reale utilizzando il CDNA e i primer come indicato sopra per determinare la quantità relativa dei trascritti virali.

In riferimento a quello del gene di mantenimento dell'ospite, Mavs è l'acronimo di mitochondrial antiviral signaling, come mostrato qui. La molecola adattatrice Mavs trasmette il segnale dai recettori citosolici simili a rig eye verso l'attivazione di NF-kappa B e dei fattori regolatori dell'interferone (IRFs), che a loro volta aumentano l'espressione genica di citochine pro-infiammatorie e interferoni. Qui sono mostrati i carichi virali nei polmoni di topi selvatici infettati da gamma HV e di topi appartenenti alla stessa nidiata privi di Mavs.

La carenza di Mavs ha ridotto significativamente il carico virale nel polmone a 10 giorni dall'infezione, indicando che Mavs è necessario per un'infezione virale efficiente in vivo. Questa figura mostra una curva di crescita multi-step virale su fibroblasti embrionali di topo di tipo selvaggio e su quelli carenti di Mavs. La crescita virale risulta significativamente ritardata nei fibroblasti embrionali di topo, indicando che Mavs è richiesto per una replicazione virale efficiente in vitro. I livelli di mRNA dei geni litici virali in fibroblasti embrionali di topo infettati con gamma HV 68 sono stati analizzati mediante PCR in tempo reale: la carenza di Mavs ha ridotto significativamente i livelli di mRNA di tre geni litici essenziali.

Tutti questi risultati supportano collettivamente la conclusione che Mavs è necessario per l'attivazione della trascrizione del gamma HV 68 e per la replicazione litica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare l'interazione tra ospite e patogeno a più livelli, sia in VO che in Vevo. Non dimenticare che lavorare con i patogeni potrebbe essere estremamente rischioso.

Devono essere adottate precauzioni, come l'indossare dispositivi di protezione individuale, durante lo svolgimento delle operazioni.