Separazione di DNA a singolo filamento, doppia elica del DNA e RNA da una Comunità Ambientale virale usando la cromatografia idrossiapatite

Questo video illustra una procedura per separare assemblaggi virali misti in base alla loro composizione di acidi nucleici. Questo consente lo studio della diversità tassonomica e del potenziale funzionale di assemblaggi virali complessi. In questo caso, l'idrossiapatite, una forma cristallina di fosfato di calcio, viene utilizzata per la separazione degli acidi nucleici.

Prima di tutto, si impacchetta e si equilibra una colonna di idrossiapatite; successivamente, si applicano sulla colonna gli acidi nucleici virali purificati. L'interazione elettrostatica tra gli ioni calcio positivi dell'idrossiapatite e la struttura fosfato negativa degli acidi nucleici ne determina il legame alla colonna. Successivamente, il DNA-RNA a singolo filamento e il DNA a doppio filamento vengono eluiti in modo sequenziale utilizzando concentrazioni diverse di tampone fosfato. Gli acidi nucleici ottenuti vengono quindi desalati e concentrati, in previsione della loro visualizzazione, quantificazione e identificazione mediante sequenziamento del DNA. L'elettroforesi su gel di agarosio conferma che le diverse specie di acidi nucleici possono essere separate con un trasferimento incrociato inferiore al 9%.

Pertanto, questo metodo consente la valutazione della diversità e della capacità funzionale delle comunità virali. Salve, mi chiamo Doug Fro e sono un ricercatore associato nel laboratorio della dottoressa Shannon Williamson presso il j Craig Venture Institute. Oggi vi mostrerò un procedimento per separare il DNA a singolo filamento, il DNA a doppio filamento e l'RNA da un'assemblea virale ambientale.

Questo metodo presenta vantaggi rispetto ai metodi esistenti, come il trattamento con il nucleo, che ha come bersaglio il DNA o l'RNA. La cromatografia su idrossiapatite ha la capacità di catturare l'intera comunità virale. Questo metodo ci consente di rispondere a diverse domande nel campo dell'ecologia virale.

Ad esempio, qual è il complemento genico totale o la diversità della comunità virale? Abbiamo pensato a questo metodo per la prima volta quando abbiamo voluto studiare l'intera assemblaggio del plancton del Rio proveniente dalla Baia di Chesapeake senza sacrificare un sottoinsieme della firma genetica. Le soluzioni necessarie per questo esperimento devono essere preparate in anticipo seguendo le istruzioni riportate nel protocollo scritto allegato e includono tampone fosfato 0,12 molare, tampone fosfato 0,20 molare, tampone fosfato 0,40 molare e soluzione fosfato uno molare.

Tutti a pH 6,8 e idrossiapatite idratata nel giorno dell'esperimento, equilibrare tutti i tamponi fosfato e l'idrossiapatite idratata ponendoli in un bagno d'acqua a 60 gradi Celsius. Iniziare questa procedura preparando la colonna econo che verrà utilizzata per la separazione degli acidi nucleici virali. Applicare un rubinetto all'estremità della colonna econo e assicurarsi che sia chiuso.

Utilizzando una pipetta, aggiungere acqua deionizzata sulla colonna, quindi posizionare il tappo sulla parte superiore della colonna e capovolgerla ripetutamente per eseguire il risciacquo. Versare via l'acqua e ripetere questo lavaggio diverse volte. Successivamente, rimuovere il rubinetto dalla colonna Econ e sottoporlo ad autoclave per sterilizzarlo.

Il rubinetto non è sterilizzabile in autoclave poiché si scioglierebbe. Risciacquare il rubinetto con acqua ionizzata, quindi nuovamente con etanolo al 70% e lasciarlo asciugare all'aria dopo la sterilizzazione in autoclave. Sostituire il rubinetto e chiuderlo.

Successivamente, lavorando in una cappa, aggiungere un millilitro di sigma coat alla colonna e rivestire la superficie di vetro della colonna capovolgendo la colonna con un movimento rotatorio, come mostrato qui. Il rivestimento con sigma coat ridurrà al minimo l'adesione degli acidi nucleici alla superficie di vetro. Durante la separazione, le superfici di vetro sono state rivestite con un sale.

Aprire il rubinetto e travasare in un tubo conico. Successivamente, per collegare la colonna a un bagno termostatato ad acqua circolante, utilizzare due morsetti per fissare la colonna a un treppiede. Collegare un tubo di silicone proveniente dal bagno termostatato, in modo che il flusso dell'acqua proceda dal basso verso l'alto.

Impostare la temperatura a 60 gradi Celsius e avviare la circolazione. In pratica, la colonna e i tubi verrebbero avvolti in un materiale isolante, come carta d'alluminio o isolante termico per tubi. Per ridurre al minimo la dispersione di calore, questo passaggio non è mostrato qui.

Per visualizzare meglio la procedura, chiudere il rubinetto. Utilizzando una pipetta, aggiungere 10 millilitri di acqua sterile priva di RNA. Aprire il rubinetto e lasciare scorrere l'acqua.

Quindi lavare nuovamente seguendo il secondo lavaggio. Risciacquare due volte con 10 millilitri di tampone fosfato sterile privo di RNAsi 0,12 M e decantare tra un lavaggio e l'altro. La colonna è ora pronta per la cromatografia su idrossiapatite.

Assicurarsi che il rubinetto della colonna econ sia chiuso. Quindi, utilizzando una pipetta sierologica sterile da due millilitri, aggiungere lentamente due millilitri del preparato di idrossiapatite riidratata e risospesa sul fondo della colonna. Rimettere il tappo della colonna.

Lasciare sedimentare l'idrossi apatite sotto l'effetto della forza di gravità per 30 minuti. Questo metodo richiede attenzione ai dettagli. La colonna di idrossi apatite si processa a una velocità compresa tra 0,25 e 0,5 mils al minuto.

Pertanto, è molto importante controllare attentamente la colonna per evitare che si secchi. Trascorsi 30 minuti, aprire il rubinetto per far defluire il tampone in un contenitore per rifiuti. Chiudere il rubinetto e scartare il flusso iniziale.

Combinare gli acidi nucleici con un tampone fosfato 0,12 M in un volume finale di 500 microlitri e incubare a 60 gradi Celsius per 10 minuti. Questo permette di equilibrare gli acidi nucleici alla temperatura della colonna e migliora la separazione delle diverse specie di acidi nucleici rimuovendo eventuali strutture secondarie presenti. Utilizzando una pipetta serologica da due millilitri, applicare rapidamente la soluzione di acidi nucleici sulla idrossiapatite, avendo cura di non disturbare la colonna.

Una volta che tutti i 500 microlitri sono passati sulla colonna, è possibile aggiungere una piccola quantità di tampone fosfato 0,12 molare sulla parte superiore della colonna per evitare che si secchi. Lasciare che gli acidi nucleici si leghino all’idrossiapatite per 30 minuti. Al termine dell’incubazione di legame, posizionare un tubo conico da 15 millilitri sotto la colonna.

Quindi aprire il rubinetto e raccogliere il campione iniziale di 500 microlitri, che contiene DNA a filamento singolo. Una volta raccolti 500 microlitri, chiudere il rubinetto. Successivamente, aggiungere sei millilitri di tampone fosfato 0,12 molar alla idrossiapatite, avendo cura di non disturbare la colonna.

Quindi aprire il rubinetto e continuare a raccogliere il flusso passante contenente DNA a filamento singolo nello stesso tubo da 15 millilitri del passaggio precedente. Dopo aver raccolto circa sei millilitri, chiudere il rubinetto. Aggiungere un volume di una soluzione di fenolo cloroformio alcol isoamilo al tubo, mescolare vigorosamente mediante vortex, quindi centrifugare a 3.500 ×g per 15 minuti.

Dopo la centrifugazione, il tubo conterrà due strati. Trasferire lo strato superiore acquoso, che contiene il filamento singolo di DNA, in un nuovo tubo da 15 millilitri e conservare il campione a temperatura ambiente per eluire e purificare l'RNA dalla colonna, aggiungere sei millilitri di tampone fosfato 0,20 molare e raccogliere i passaggi liberi utilizzando un nuovo tubo da 15 millilitri. Successivamente, eseguire un'estrazione con fenolo-cloroformio.

Per quanto riguarda il campione di DNA a singolo filamento, ripetere questo processo utilizzando sei millilitri di tampone fosfato 0,40 M per eluire e purificare il DNA a doppio filamento dalla colonna. Infine, per rimuovere dalla colonna qualsiasi residuo di DNA a doppio filamento, ripetere nuovamente questo processo una volta in più.

Questa volta utilizzare sei millilitri di tampone fosfato 1,00 M per desalinare i campioni di acidi nucleici. Trasferire quattro-cinque millilitri di ciascun campione su un dispositivo filtrante centrifugo Ultra-4 dotato di una membrana con cutoff di peso molecolare a 30.000 per concentrare il campione a meno di 500 microlitri, centrifugando a 6.000 ×g a 30 gradi Celsius per circa cinque minuti in un rotore ad angolo fisso. Dopo aver scartato il flusso passante, aggiungere il resto del campione al filtro.

Portare il volume a quattro-cinque millilitri con tampone 1X TE privo di RNAsi. Quindi centrifugare nuovamente fino al raggiungimento di un volume concentrato. Circa cinque minuti dopo la centrifugazione, aggiungere quattro-cinque millilitri di tampone 1X TE privo di RNAsi al filtro e concentrare.

Ripetere nuovamente questo lavaggio per altre cinque volte per desalinare completamente i campioni di acidi nucleici. Una volta che i campioni sono stati completamente concentrati e desalinati, trasferire i campioni rimanenti di acidi nucleici in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,7 millilitri. Precipitare gli acidi nucleici aggiungendo un decimo del volume di acetato di sodio, due volumi di etanolo al 100% e un microlitro di glyco blue, mescolando bene mediante vortex e centrifuga.

Un 28.000 GS a quattro gradi Celsius per 60 minuti a Kent. Assicurarsi di non disturbare il pellet.

Aggiungere 300 microlitri di etanolo al 70%, centrifugare a 28.000 ×g a temperatura ambiente per 10 minuti senza far asciugare completamente, quindi risospendere ogni frazione in un volume appropriato di tampone TE privo di RNA. Concentrazioni equimolari di acidi nucleici virali M13 MP18, DNA a filamento singolo MS2, RNA a filamento singolo FI6, RNA a doppio filamento e DNA a doppio filamento lambda sono state combinate, quindi separate mediante cromatografia su idrossiapatite come mostrato in questo video. Concentrazioni equimolari di M13 MP18, DNA a filamento singolo MS2, RNA a filamento singolo FI6, RNA a doppio filamento e DNA a doppio filamento lambda sono state combinate come mostrato nella corsia sei ed applicate a una colonna di idrossiapatite, come si può vedere qui.

Il D-N-A a filamento singolo, l'R-N-A e il D-N-A a doppio filamento sono stati eluiti separatamente dalla colonna di idrossiapatite utilizzando tampone fosfato 0,12 molare, 0,18 molare, 0,40 molare e 1,00 molare. È stata utilizzata una scala molecolare da un KB per confermare le dimensioni del genoma. Questi risultati indicano che questo metodo può essere utilizzato per separare con successo il D-N-A a filamento singolo, il D-N-A a doppio filamento e l'R-N-A con un trasferimento residuo inferiore al 9% da una frazione alla successiva.

Questo metodo è stato inoltre utilizzato per separare gli acidi nucleici isolati da una comunità virale all'interno della Chesapeake Bay, come mostrato qui. Il D-N-A-R-N-A a singolo filamento e il DNA a doppio filamento sono stati separati indipendentemente utilizzando concentrazioni di tampone fosfato di 0,12 molare, 0,20 molare e 0,40 molare, oppure 1,00 molare rispettivamente. Una scala ponderale di DNA ad alto peso molecolare nella corsia uno e una scala da 1 KB nella corsia due sono state utilizzate per confermare visivamente il peso molecolare approssimativo e la massa degli acidi nucleici, come si può osservare qui. Il DNA a doppio filamento è risultato il tipo dominante di acido nucleico estratto dal plancton virale della Chesapeake Bay. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come separare gli acidi nucleici da un'associazione virale mista mediante cromatografia su idrossiapatite.

Questo include la preparazione della colonna di idrossiapatite e degli acidi nucleici, la separazione e l'elusione degli acidi nucleici utilizzando diverse concentrazioni di tampone fosfato e la desalazione, nonché la concentrazione degli acidi nucleici dopo la separazione.