Saggio basato su cellule di calcio per le medie e High Throughput Screening del PRT Funzioni canale utilizzando FlexStation 3

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare l'applicazione del Flex Station Three per studiare il profilo farmacologico del canale del recettore potenziale transitorio, o TRPA1. Questo viene realizzato preparando innanzitutto cellule che esprimono canali TRPA1 in piastre microtitolazione da 96 pozzetti.

Dopo aver lavato le cellule in un lavatore per micropiastre, le cellule vengono caricate con il colorante fluorescente sensibile al calcio. Flu oh 4:00 AM un periodo di caricamento cellulare è quindi seguito da diversi ulteriori lavaggi. Il passaggio successivo della procedura consiste nel preparare la piastra dei composti, inclusi un agonista trip a uno e un antagonista putativo trip a uno.

Come passaggio finale, si configurano i parametri del software per la lettura della piastra nel sistema Flex Station three. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano relazioni dose-risposta per l'attivazione di trip A uno indotta dall'acido flu fonemico e l'inibizione da parte del composto antagonista A. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui meccanismi di attivazione del 21 mediante la misurazione dell'ingresso di calcio, può essere applicato anche allo studio delle funzioni di altri canali ionici permeabili al calcio e di recettori accoppiati a proteine G utilizzando coloranti sensibili al calcio come i frozen dye o i coloranti per il potenziale di membrana.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'imaging al calcio e la mappatura manuale con patch è che questo metodo risparmia tempo e consente uno screening ad alto rendimento della funzione e della modulazione del calcio, dei canali del ferro e di altri recettori mobilitanti il calcio. Prima di iniziare questo protocollo, coltivare cellule HEC 293 stabilmente trasfettate con trip A uno fino a una densità del 70-90%, come descritto nel protocollo scritto. Per iniziare la preparazione delle cellule per il saggio del calcio, rivestire le piastre a 96 pozzetti pipettando 50 microlitri di poli-L-ornitina in ciascun pozzetto e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per almeno 15 minuti.

Dopo l'incubazione, risciacquare le cellule una volta con soluzione salina tamponata al fosfato di KO. Dopo la tripsina, trasferire la quantità desiderata di cellule HEC 293 in un tubo conico sterile da 15 millilitri e centrifugare il campione. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet cellulare risultante.

Nel mezzo di coltura DMEM integrato con siero fetale bovino inattivato al 10%, distribuire 100 microlitri di sospensione cellulare in ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Utilizzando una pipetta multicanale, lasciare riposare la piastra nell'incubatrice per almeno 30 minuti prima di posizionarla nell'incubatore cellulare umidificato per 20-44 ore. Per la preparazione del saggio del calcio, preparare innanzitutto le soluzioni come descritto nel protocollo scritto.

Dopo averlo preparato, mescolare 10 microlitri di flu oh 4:00 AM uno millimolare con 10 microlitri di onic. F1 27, quindi trasferire l'intero contenuto in cinque millilitri di tampone per saggio flu. Oh quattro integrato con lo 0,1% di albumina sierica bovina.

Successivamente, lavare le cellule coltivate in piastre a 96 pozzetti con HBSS a 80 microlitri per pozzetto, due volte, utilizzando un lavatore per micropiastre. Dopo il lavaggio, aggiungere la soluzione di carico flu oh 4:00 AM a 50 microlitri per pozzetto mediante un pipettatore multicanale e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora. Durante il periodo di carico cellulare di un'ora, preparare una serie di soluzioni tre volte concentrate di agonisti, una serie di soluzioni tre volte concentrate di antagonisti e un volume elevato di agonista 300 micromolare nel buffer per saggio flu oh quattro, utilizzando la pipetta.

300 microlitri delle soluzioni del composto diluito in una piastra per composti a 96 pozzetti. Disporre in modo da avere la diluizione seriale di un composto e i corrispondenti controlli positivo e negativo nella stessa colonna della piastra per composti, ogni volta che possibile. Poiché il Flex station three legge una singola colonna alla volta, pipettare 300 microlitri della soluzione di agonista a 300 micromolari accanto a ciascun pozzetto contenente l'antagonista come passaggio finale di preparazione delle cellule.

Lavare le cellule caricate tre volte con il tampone acido flu oh quattro utilizzando il lavatore a micropiastre dopo l'ultimo lavaggio. Lasciare 80 microlitri di tampone acido flu oh quattro in ogni pozzetto. Per iniziare la lettura della piastra, accendere il sistema Flex Station tre e avviare il software Soft Max Pro 5.2.

Salvare l'esperimento con un nuovo nome di file durante la configurazione. Selezionare la modalità flex e impostare i parametri per misurare l'effetto dell'agonista e dell'antagonista come indicato nella procedura scritta. Successivamente, posizionare una nuova cassetta di punte, la piastra dei composti e la piastra di lettura nei vassoi appropriati della stazione Flex.Three.

Avviare la lettura della piastra cliccando sul pulsante di lettura nel software Soft Max Pro. Il Flex Station tre leggerà una colonna alla volta e aggiungerà i composti nei punti temporali preprogrammati senza interrompere la lettura. Al termine dell'esecuzione, i dati sperimentali possono essere elaborati direttamente utilizzando il software Soft Max PRO oppure copiati e incollati in qualsiasi programma di foglio elettronico, come Microsoft Excel.

Per analizzare i dati, generare curve di risposta alla concentrazione per l'agonista trip a one, l'acido flu fonemico, e per il presunto composto antagonista trip a one, il composto A, utilizzando un adattamento ai minimi quadrati come descritto nella procedura scritta trip. Trip a one è un canale cationico permeabile al calcio il cui attivazione provoca un ingresso di calcio rilevabile mediante il colorante sensibile al calcio flu oh 4:00 AM. Tracce rappresentative dei profili temporali delle variazioni di fluorescenza in risposta a una serie di concentrazioni di acido flu fonemico o FFA sono mostrate a concentrazioni più elevate. L'FFA induce aumenti di fluorescenza con una cinetica molto più rapida rispetto a concentrazioni più basse, nonostante livelli di picco di fluorescenza simili.

Per distinguere queste differenze, la relazione concentrazione-risposta è stata costruita misurando le velocità iniziali dell'aumento della fluorescenza. Dopo l'aggiunta di concentrazioni variabili di FFA, la concentrazione efficace massima al 50% di FFA è risultata pari a 55,4 micromolare. È inoltre mostrata la relazione concentrazione-risposta dell'inibizione della risposta al calcio indotta da FFA da parte di un presunto antagonista del recettore TRPA1, il composto A.

Una dose ha ridotto in modo indipendente la risposta delle cellule triplo A uno all'FFA con una concentrazione inibitoria massima al 50% di 4,3 micromolare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come studiare i profili farmacologici dei canali triplo A uno e quelli correlati utilizzando la flag station tre.