CD4 + T-linfociti Capture utilizzando un chip monouso Microfluidic per l'HIV

Ciao, mi chiamo Richard Lin e sono un ricercatore nel gruppo della Professoressa TI Mercy presso la Divisione di Scienze e Tecnologie Sanitarie di Harvard e MIT. Il progetto su cui sto lavorando consiste nel quantificare e isolare linfociti T positivi per CD4 e positivi per C3. Il sangue del paziente verrà utilizzato in contesti con risorse limitate.

Proprio di fronte a me abbiamo un dispositivo microfill composto da PDMS, cioè polidimetilsilossano. Il dispositivo, il canale stesso, ha un'altezza di 50 micrometri e il volume totale nel dispositivo è di 10 microlitri. Si tratta quindi di un dispositivo estremamente preciso che utilizzeremo per catturare i linfociti T helper.

Fondamentalmente, il parametro diagnostico di riferimento per i pazienti HIV. La superficie del dispositivo microfluidico è già stata preparata con proteine e anticorpi positivi per CD4 nella siringa. Al momento abbiamo solo tampone biologico PBS a un pH di 7,4 e ora lo faremo fluire nel canale per rimuovere l'eccesso di anticorpi positivi per CD4.

In questa fase, non è necessario controllare la velocità perché stiamo semplicemente cercando di eliminare le sostanze in eccesso e non importa realmente quale sia la nostra velocità. Questo è il punto in cui si troveranno gli ingressi del dispositivo e questi saranno le uscite, alla mia sinistra e alla vostra destra. Ora provvederò a eliminare la soluzione di anticorpi in eccesso e, se osservate l'uscita, potete notare il liquido che fuoriesce; si tratta di una quantità molto piccola, ma se guardate attentamente potete vedere il liquido che esce dal canale attraverso il tubo.

Ora che abbiamo eliminato la soluzione di anticorpi in eccesso, possiamo prepararci a infondere il sangue. Ora scollegherò il tubo dall'ingresso. Prepareremo quindi una nuova siringa per il sangue, sangue umano, sangue intero.

Quindi non si tratta di un campione proveniente da un paziente, ma di un campione sano, da un soggetto sano, mentre ci prepariamo a iniettare il sangue nel dispositivo microfluidico. Collegheremo quindi la siringa alla pompa per siringa. Ora l'azioneremo e potrete osservare le portate della siringa, che abbiamo impostato a cinque microlitri al minuto.

Ora ci prepariamo essenzialmente a iniettare nel sangue. Posizioneremo il pompa-siringa in verticale perché, come sappiamo, le cellule sanguigne si sedimentano e vogliamo che le cellule fluiscano nel canale. È quindi preferibile che la sedimentazione cellulare avvenga in fondo, proprio vicino al nostro tubo.

Ora tutto è pronto per iniziare. Il volume del mio dispositivo è di 10 microlitri per 10 microlitri. E il volume che vogliamo far fluire nella parete del canale è anch'esso di 10 microlitri.

Quindi posso capire se ho fatto affluire abbastanza sangue semplicemente osservando il colore del canale: se è tutto rosso e completamente riempito, so che ho introdotto 10 microlitri e devo fermare lo stantuffo della siringa. Ora premerò il pulsante di avvio e il flusso inizierà, anche se a volte occorre un po’ di tempo prima che il sangue effettivamente entri nel canale. Questo fenomeno è spesso dovuto alla pressione.

Ad esempio, quando posizioniamo la siringa, a volte dobbiamo, come dire, aspirare o iniettare il liquido di conseguenza per regolare il sangue all'interno del tubo. Potrebbe volerci un po' di tempo, ma una volta che inizia a pompare in un canale, la portata è impostata a ly al minuto, che è ciò che desideriamo. Dovremo quindi avere un po' di pazienza e aspettare; a volte è necessario attendere due o tre minuti prima che il sangue inizi a fluire nel canale.

In realtà, si può vedere che il sangue sta iniziando a entrare nel canale. Quindi si può notare che il dispositivo è quasi completamente pieno. Bene, ora riporteremo il tubo al PBS per rimuovere il sangue presente nel canale.

E per fare ciò ripeteremo ciò che abbiamo già fatto per rimuovere il tubo. Poiché dobbiamo ancora controllare la velocità di flusso del PBS, abbiamo ancora bisogno della pompa per siringa. Tuttavia, dato che non stiamo più facendo scorrere sangue, non è necessario mantenere la pompa per siringa in posizione verticale perché non ci sono cellule nel PBS.

Ora siamo pronti e procederemo a rimuovere il sangue dal dispositivo; premerò nuovamente il pulsante appuntito proprio qui. Come potete vedere, il dispositivo sta iniziando a svuotarsi. Ai bordi è ancora presente un po' di sangue, ma sta lentamente scomparendo.

Quindi, una volta che tutto il sangue sarà stato rimosso, aumenteremo la velocità da cinque microlitri al minuto a 20 microlitri al minuto. Il motivo di questa variazione è che nel sangue sono presenti in realtà due tipi cellulari che esprimono antigeni C4 positivi. Uno di questi è quello che stavamo cercando, ovvero i linfociti T helper.

L'altro tipo è quello che chiamiamo monociti. Vogliamo assicurarci che il nostro dispositivo catturi in modo specifico soltanto i linfociti T helper, piuttosto che sia i linfociti T helper sia i monociti. Il metodo che utilizziamo per farlo consiste nell'aumentare la velocità di flusso, poiché sappiamo che i monociti sono più grandi rispetto alle cellule T helper.

Quindi, aumentando le portate, i monociti più grandi subiranno una pressione maggiore a staccarsi dalla superficie rispetto alle cellule T helper CD4 positive. Ora siamo all'incirca a 20 minuti. Quello che ho ora in mano è una soluzione.

Viene chiamata soluzione di lisi per piastrine. Lo scopo di questa soluzione è lisare i globuli rossi. Quindi, in qualsiasi punto i globuli rossi rimangano nel canale, questa soluzione li liserà.

Questa viene diluita 10 volte, per 10 volte, a partire dalla soluzione madre. Ora procederemo quindi a fermare la pompa per siringa, rimuovere il tubicino e sostituire fondamentalmente la soluzione con quella contenuta in questa siringa. Quindi ora fermo la macchina, rimuovo il tubicino, stacco questo, lo collego a questa siringa, e lo sostituisco con uno nuovo.

Ok, ora che ho predisposto tutto, ridurremo la portata a cinque microlitri al minuto. Quindi faremo clic sulla portata da 20 e la ridurremo a cinque; ora faremo fluire la soluzione di fax license per 20 minuti. A questo punto premeremo start.

Di fronte a noi c'è attualmente un'immagine ottica del dispositivo, acquisita con un ingrandimento di 10x. È possibile riconoscere tutti questi puntini bianchi. Ma come possiamo essere sicuri che queste cellule siano proprio quelle che stiamo cercando?

Quindi utilizziamo diversi coloranti per verificare che il primo colorante che impieghiamo sia quello che chiamiamo DPI, che colora il nucleo. Fondamentalmente, tutte le cellule con nucleo, come i globuli bianchi, vengono colorate, mentre, ad esempio, i globuli rossi, che non possiedono nucleo, non vengono colorati. Si può notare che il colorante è presente in tutta l'immagine: ci sono molti puntini blu e ogni singolo punto blu corrisponde a una cellula colorata.

è una cellula. Ora il passo successivo consiste nel verificare se le cellule possiedono l'antigene C four positivo, come lo chiamiamo noi. Questo è estremamente importante perché l'intero scopo del nostro dispositivo è catturare cellule C four positive.

Quindi il prossimo anticorpo fluorescente che utilizziamo è naturalmente specifico per C quattro. Passare alla diapositiva successiva. In questa immagine, le cellule appaiono molto più deboli perché l'anticorpo fluorescente che utilizziamo è solitamente destinato ai fatti.

Quindi il grado di diluizione è molto maggiore. Tuttavia, osservando con attenzione, si può ancora notare la presenza di puntini sparsi in questo campo visivo. Sono piuttosto deboli.

Tuttavia, esaminandole più attentamente, possiamo constatare che queste cellule sono in DC per positività, il che è positivo perché è esattamente ciò che desideriamo. E il test successivo è, come ho menzionato in precedenza, che esistono due tipi diversi di cellule C quattro positive. Uno è costituito da quelle che vogliamo, ovvero le cellule T helper, e l'altro da quelle che chiamiamo monociti.

Pertanto, abbiamo nuovamente bisogno di un altro anticorpo fluorescente per differenziare le due cellule. Sappiamo infatti che nei linfociti T helper sono presenti antigeni positivi per CD3, mentre nei monociti non lo sono.

Quindi l'anticorpo successivo che utilizziamo è specifico per CD3, che vedremo in questa immagine. Di nuovo, si può notare che i puntini sono sparsi intorno al dispositivo; i puntini appaiono più grandi perché a volte alcune cellule emettono una fluorescenza più intensa, mentre altre no. In questo caso, molti fattori dipendono dalla casualità, ma nella maggior parte dei casi, questi puntini, in particolare quelli rossi brillanti, corrispondono a cellule.

Quindi, ancora una volta, ciò che vogliamo è verificare che le nostre cellule siano positive per CD4 e positive per CD3. In questo caso, si può notare che molte delle nostre cellule sono positive per CD3, il che è un buon risultato, in quanto ci conferisce specificità nel processo di cattura.

I grandi dos, potrebbero essere spazzatura, ma molte volte ciò che accade è che a volte una cellula capita semplicemente di raccogliere più flussi di CD3, CD3 su se stessa. Quindi in questa immagine, questo è uno dei dati che abbiamo raccolto per questo dispositivo microfluidico ed è fondamentalmente un pro di cattura cellulare. Quindi nel precedente, sapete, vetrini, e simili, si può notare che ce n'erano molti, sapete, immagini con cellule sopra.

Ma a cosa si accumulano effettivamente? Si accumulano a un profilo di cattura cellulare, nel quale possiamo riportare sull'asse X la distanza dall'ingresso e sull'asse Y il disco di cattura cellulare. E si può notare che lungo il dispositivo, la densità inizialmente è estremamente elevata e poi diminuisce gradualmente, proprio come ci aspetteremmo, poiché stiamo catturando le cellule C4 positive e C3 positive dal flusso sanguigno e la concentrazione di queste cellule nel campione ematico diminuirà progressivamente.

E in pratica è così che vengono solitamente presentati i nostri dati.