Creazione transitori pori della membrana cellulare utilizzando una stampante a getto d'inchiostro standard

L'obiettivo generale di questa procedura è creare pori transitori nelle membrane cellulari utilizzando la stampa a getto d'inchiostro. Questo viene realizzato innanzitutto modificando una stampante a getto d'inchiostro standard. Il secondo passaggio consiste nell'eliminare e pulire una cartuccia d'inchiostro commerciale per permettere l'inserimento dell'inchiostro biologico.

Successivamente, le cellule di interesse vengono sospese in una soluzione di monomeri di actina marcati con fluorocromo e PBS per creare la soluzione di bioinchiostro. L'ultimo passaggio consiste nella stampa del bioinchiostro su vetrini utilizzando la stampante e la cartuccia modificate. Infine, la microscopia a fluorescenza può essere utilizzata per dimostrare che i monomeri di actina G coniugati con Fluor quattro sono stati internalizzati dalle cellule stampate attraverso pori transitori nella membrana.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche standard di trasfezione e microiniezione cellulare è che questa tecnica di stampa è facile da usare e garantisce un'elevata vitalità cellulare. Sebbene questa tecnica possa fornire informazioni nel campo della genetica, può essere applicata anche ad altri settori di studio come la biofisica cellulare e l'ingegneria tissutale. Questa tecnica può essere utilizzata per osservare facilmente lo scheletro cellulare durante la migrazione cellulare.

L'idea iniziale di questo metodo è nata quando abbiamo voluto essere in grado di visualizzare i cambiamenti nell'organizzazione del citoscheletro dovuti a forze applicate alle cellule. Iniziare sbloccando le clip di plastica dalla base inferiore della stampante, quindi rimuovere lentamente la copertura superiore di plastica. Successivamente, staccare il pannello luminoso del display dei pulsanti dalla parte superiore della stampante, lasciandolo collegato alla scheda madre della stampante.

Utilizzando salviette Kim e etanolo, pulire l'interno della stampante, in particolare le aree in cui si posiziona la cartuccia dell'inchiostro e dove avviene la stampa. Successivamente, individuare il cavo che fornisce energia ai meccanismi di alimentazione della carta per la stampante HP Desk Jet 500.

Si trovano appena sotto il vassoio della carta a sinistra della parte anteriore; scollegare i cavi dalla scheda madre. Ora individuare il meccanismo di rilevamento della carta e fissare un'ansa di filo alla leva di plastica grigia situata sopra e dietro il meccanismo di alimentazione della carta, in modo da creare una manopola manuale; posizionare qui una piattaforma. Il supporto in schiuma per il trasporto di 15 provette da centrifuga viene utilizzato insieme a diversi vetrini microscopici fissati con del nastro nella zona di stampa davanti al meccanismo di alimentazione della carta, per portare i vetrini desiderati a un livello appena al di sotto della testina di stampa del cartuccia.

Infine, per mantenere una tecnica asettica, posizionare la stampante all'interno di una cappa a flusso laminare. Iniziare rimuovendo la cartuccia dalla confezione, lasciando la pellicola protettiva che copre i contatti della stampante e la testina di stampa. Stabilizzare il corpo della cartuccia con una pinza, lasciando libera da ostacoli la parte superiore verde, utilizzando uno strumento di taglio rotante portatile.

Tagliare la parte superiore verde della cartuccia, svuotare qualsiasi inchiostro residuo dal serbatoio, quindi rimuovere il nastro protettivo di plastica che copre i contatti della stampante e la testina di stampa. È probabile che l'acqua fuoriesca dalla testina di stampa durante questo procedimento, ma ciò non arrecherà alcun danno alla cartuccia. Quando l'acqua scorrerà limpida, lasciare asciugare la cartuccia.

Per mantenere un ambiente di stampa pulito, iniziare immergendo completamente la cartuccia in un becher pieno di acqua deionizzata, quindi sottoporre la cartuccia a sonificazione per 15 minuti. Dopo la sonificazione, rimuovere la cartuccia e scuotere per eliminare l'acqua in eccesso. Spruzzare etanolo al 70% all'interno della cartuccia per creare un ambiente più asettico.

Dopo aver raccolto le cellule di interesse, centrifugare le cellule in cinque millilitri di mezzo fresco in un tubo conico da 15 millilitri per cinque minuti a 250 ×g a temperatura ambiente. Successivamente, aspirare il mezzo e quindi risospendere le cellule a una concentrazione di 1 × 10⁵ cellule per millilitro in soluzione stock fluorescente di G-actina appena preparata. Per creare l’inchiostro biologico, si noti che 250 microlitri di inchiostro biologico permettono di stampare tre coprioggetti con il modello a linee mostrato qui. Dopo aver acceso la stampante e averla fatta riscaldare, posizionare la superficie di stampa desiderata qui; vengono utilizzati coprioggetti da 22 millimetri per 22 millimetri al centro della piattaforma precedentemente assemblata.

Successivamente, aprire un programma di disegno e selezionare il modello desiderato. Ora pipettare circa da 100 a 120 microlitri della sospensione cellulare nel piccolo pozzetto circolare situato nella parte inferiore del comparto della cartuccia. Stampare il file mentre la stampante si riscalda nuovamente; la cartuccia si sposterà nella posizione pronta.

Quando la cartuccia si sposta leggermente a sinistra rispetto al pozzetto di gocciolamento dell'inchiostro e rimane in quella posizione, sollevare il meccanismo di avanzamento della carta: a questo punto il filo si muoverà e la stampa avrà inizio. La stampante stamperà sul cover slip posizionato al centro del piano di stampa utilizzando una stampante a getto d'inchiostro HP DeskJet 500 con un inchiostro biologico costituito da una sospensione di cellule fibroblastiche in una soluzione di monomero di actina G.

All'interno di una cartuccia d'inchiostro della serie HP 26, delle cellule di fibroblasti sono state stampate su vetrini di vetro per microscopio. Questa figura illustra un risultato rappresentativo di cellule di fibroblasti stampate che mostrano monomeri di actina fluorescenti incorporati. Questo schema è stato utilizzato nella figura precedente per creare una linea continua della soluzione di stampa sulla maggior parte del vetrino.

In questa figura, viene mostrata la linea retta in cui biolink e cellule sono stati depositati reciprocamente. Si noti che immediatamente dopo la stampa, si verifica un aumento della fluorescenza di fondo poiché la soluzione di biolink in cui le cellule sono sospese contiene monomeri di actina fluorescenti liberi in eccesso; l'incubazione delle cellule per circa 10 minuti dopo la stampa favorisce l'adesione al vetrino, consentendo di rimuovere con un mezzo di crescita fresco la soluzione in eccesso del monomero dal substrato, riducendo significativamente la fluorescenza di fondo. Qui, un'immagine rappresentativa di tre fibroblasti T3 stampati in una zona localizzata di stampa: come mostrato, questa microfotografia al microscopio fluorescente di una cellula acquisita 15 minuti dopo la stampa mostra l'actina in verde, il nucleo in blu e la sovrapposizione sia dell'actina GI che del colorante nucleare.

Le prossime due immagini mostrano la microscopia a fluorescenza di due fibroblasti disposti in un modello lineare tre ore dopo la stampa. Questa prima immagine mostra i monomeri di actina marcati con fluorescenza all'interno delle cellule. Questa seconda immagine è una sovrapposizione del canale a fluorescenza con l'immagine di sfondo, per mostrare che, sebbene possa esserci qualche detrito sul vetrino nell'angolo in basso a sinistra, questo non emette fluorescenza.

Infine, viene presentato un gruppo di controllo di cellule non stampate incubate per tre ore con monomeri marcati fluorescentemente, al fine di dimostrare che i monomeri non possono penetrare la membrana cellulare senza la permeabilizzazione mediata dalla stampa cellulare. Durante il tentativo di questa procedura, è importante avere a disposizione diverse cartucce pulite e pronte all'uso, poiché l'ostruzione della stampante è uno dei problemi che rallenta questa tecnica. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come convertire una stampante desktop standard per stampare cellule vive, il che contribuisce a creare una forza transitoria sulla membrana.