Singolo Destino Mapping di celle in Zebrafish

L'obiettivo generale del seguente esperimento è eseguire un mapping del destino e un tracciamento della linea cellulare di singole cellule selezionate in embrioni di pesce zebra. Questo viene ottenuto coniugando chimicamente fluoresceina cagingata a destrano ad alto peso molecolare. Successivamente, il destrano con fluoresceina cagingata preparato viene microiniettato negli embrioni di pesce zebra, quindi attivato fotochimicamente in cellule selezionate mediante assorbimento a due fotoni.

Dopo l'attivazione fotochimica degli embrioni, viene eseguita un'analisi immunohistochimica per rilevare il dextrano marcato con fluoresceina rilasciato, al fine di tracciare il destino delle cellule attivate. In definitiva, questo metodo può essere utilizzato per determinare il contributo lineare e la localizzazione tissutale delle singole cellule attivate tramite luce. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia a fluorescenza standard, è che consente di etichettare in modo differenziale singole cellule per il tracciamento del loro destino.

Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande fondamentali in biologia dello sviluppo, come ad esempio come le cellule precursori indifferenziate possano contribuire a diversi tipi di tessuti. Una dimostrazione visiva è fondamentale, poiché le fasi di montaggio dell'embrione e di attivazione fotoindotta sono difficili da apprendere sulla base esclusivamente di descrizioni testuali. Prima di iniziare, sintetizzare il dextrano di fluoresceina caging e conservarlo in provette coperte con fogli di alluminio. Successivamente, iniettare microscopivamente gli embrioni allo stadio da una a due cellule con il dextrano di fluoresceina caging sintetizzato.

Dopo che gli embrioni hanno raggiunto lo stadio appropriato di sviluppo, rivestiteli. Quindi montate gli embrioni rivestiti in agarosio a basso punto di fusione per l'attivazione fotoindotta. Una volta che l'agarosio si è solidificato, caricate il software LSM 510.

Posizionare un filtro giallo trasparente nel percorso del fascio di luce bianca, quindi selezionare l'opzione per acquisire una nuova immagine e fare clic su "avvia modalità esperto". Selezionare la scheda del laser, attivare le sorgenti laser al plasma di argon e al mi tai. Impostare la lunghezza d'onda del mi tai a settecentoquaranta nanometri.

Successivamente, selezionare la scheda config. Impostare le configurazioni del percorso ottico per l'ione argon e il laser mi tai. Quindi selezionare la scheda scan.

Passare all'obiettivo 20 volte 0,8. Impostare la velocità massima di scansione cliccando su metodo max set e numero rispettivamente su line mean e uno nella scheda canali, deselezionando tutte le sorgenti laser tranne il mi tai. Successivamente, posizionare un misuratore di potenza nel percorso del fascio ottico, quindi selezionare il pulsante con per attivare la scansione continua.

Regolare la percentuale di trasmissione finché il misuratore di potenza indica una potenza laser media di 47 milliwatt. Quindi arrestare la scansione selezionando il pulsante di arresto nella scheda canali. Deselezionare la sorgente laser mi tai e selezionare l'argonne iron.

Quindi selezionare nuovamente il pulsante XY veloce nella scheda canali e regolare il pinhole. Regolare il guadagno di rilevamento, amplificare un offset e amplificare nuovamente per il laser al ferro di Argonne per ottenere la migliore qualità dell'immagine. Utilizzando il controllo del palchetto, individuare e mettere a fuoco la cellula da attivare, quindi fare clic sul pulsante di arresto. Utilizzando lo strumento di ritaglio, ritagliare la cellula attivata in modo che il fattore di ritaglio nella scheda modalità mostri un valore compreso tra 50 e 70.

Quindi arrestare la scansione selezionando il pulsante di arresto nella scheda canali. Deselezionare il laser a ioni di argon e selezionare il laser My Tai nella scheda modalità. Impostare la velocità di scansione a 31,46 secondi.

Quindi selezionare il pulsante singolo per avviare la scansione per l'attivazione a due fotoni della destrina di fluoresceina incapsulata della cellula selezionata. Dopo l'attivazione, passare alla scheda canali e deselezionare ora il laser mi tai, selezionando nuovamente il laser a ioni di argon. Quindi, nella modalità, impostare il fattore di zoom a uno. Successivo.

Sotto l'intestazione velocità, fare clic sul pulsante max per impostare la velocità di scansione più elevata. Per esaminare la regione attivata dalla luce, selezionare xy rapido. Quindi selezionare la scheda canali e regolare il pinhole ed eseguire nuovamente il rilevamento, verificando che la regione attivata dalla luce non sia stata ablata dal laser.

Dopo aver preparato gli embrioni fotoattivati per la rilevazione immunoistochimica del dextrano fluoresceina sbloccato seguendo il protocollo descritto nel manoscritto allegato, lavare gli embrioni sei volte in PBT e due volte in tampone AP. Successivamente, trasferire gli embrioni in piastre a nove pozzetti contenenti tampone AP.

Successivamente, aspirare il tampone AP e aggiungere N-B-T-B-C-I-P. Arrestare lo sviluppo della colorazione con N-B-T-B-C-I-P aspirando la soluzione di N-B-T-B-C-I-P. Quindi lavare gli embrioni in PBT.

Ora recuperare gli embrioni e agitarli su una piattaforma rotante per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi ripetere il lavaggio con PBT altre due volte. Infine, montare gli embrioni in agarosio a basso punto di fusione allo 0,6% e acquisire le immagini delle cellule fotoattivate utilizzando un microscopio composto eretto.

In questa figura, a sinistra è mostrata un'immagine in campo chiaro e a destra un'immagine fluorescente di un embrione di pesce zebra microiniettato con una catena di destrano di fluoresceina caging prima dell'attivazione fotochimica. Come mostrato qui, l'embrione è stato attivato fotochimicamente in uno dei somiti indicato dalla freccia nell'immagine in campo chiaro a sinistra, utilizzando una lunghezza d'onda di 407 nanometri, un tempo di scansione di 31 secondi e una potenza media del laser di 47 milliwatt. Nell'immagine a destra, successivamente all'attivazione fotochimica, si può osservare la fluorescenza derivante dal destrano di fluoresceina deschermato.

La colorazione immunitaria del dextrano fluoresceina sbloccato è mostrata in una piccola regione della placca laterale, nel mesoderma di un embrione allo stadio di 10 so miti, attivato fotochimicamente utilizzando gli stessi parametri laser della figura precedente mediante la procedura di rilevamento immunoistochimico. La regione attivata, indicata qui dalla freccia, può essere identificata con una colorazione di fondo minima seguendo questa procedura.

Un'analisi aggiuntiva, come la colorazione immunoistochimica per diversi marcatori specifici dei tessuti, può essere eseguita per caratterizzare meglio la localizzazione e il destino delle cellule marcate. Utilizzando questa tecnica, si apre la strada ai ricercatori nel campo della biologia vascolare per studiare l'origine delle cellule progenitrici arteriose e venose negli embrioni di pesce zebra in via di sviluppo. Non dimenticare che quando si lavora con reagenti chimici come NBT e BCIP, questi possono essere estremamente pericolosi e si dovrebbero sempre indossare guanti.