Espianti blastomero al test per l'Impegno cellulare Fate durante lo sviluppo embrionale

Il metodo mostrato in questo video utilizza mappe del destino dello stadio di segmentazione dell'embrione opus per identificare singole colture di blaster in isolamento, al fine di valutare se il solfato embrionale sia determinato da istruzioni intrinseche o estrinseche. Inizialmente, vengono raccolti embrioni a due cellule in cui il primo solco di segmentazione biseca l'area leggermente pigmentata dell'emisfero animale. Questi embrioni vengono coltivati fino a quando raggiungono da 16 a 32 cellule, quindi viene rimossa la membrana vitellina e le cellule adiacenti vengono dissezionate a partire dalla cellula scelta. Ad esempio, il blaster dissezionato viene quindi trasferito in una depressione presente in una pozzetta di coltura rivestita con agarosio e coltivato.

Una volta che l'esplan raggiunge lo stadio desiderato, viene raccolto per valutare l'espressione genica o proteica mediante ibridazione in situ, QPCR o immunohistochimica. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altre, come la coltura di grandi gruppi di cellule embrionali o di organi in login, è che singoli blastomeri embrionali, il cui destino dello sviluppo è noto grazie a studi di tracciamento della linea cellulare, possono essere coltivati senza l'aggiunta di fattori di crescita o la presenza di cellule adiacenti. Pertanto, è possibile verificare direttamente se fattori intrinseci alla cellula indirizzano il blastomero a diventare precursore di un tessuto specifico o se siano necessari segnali provenienti da cellule circostanti.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la dissezione dei blastomeri e il loro trasferimento nelle pozzette di coltura richiedono manipolazioni delicate al microscopio stereo. In questo video, utilizzerò questo metodo per dimostrare se gli mRNA di origine materna indirizzano le cellule verso un destino neurale. Lavorando al microscopio di dissezione, affilare quattro coppie di pinzette utilizzando la pellicola abrasiva Illumina.

Una coppia di pinzette funge da riserva nel caso in cui la punta venga danneggiata durante la procedura; sterilizzare in autoclave tutte e quattro le pinzette e conservarle in un contenitore sterile. Preparare 500 millilitri ciascuno di soluzione salina di Barth modificata (MBS) 0,1 x e 1,0 x, quindi filtrare e sterilizzare. Conservare queste soluzioni da mesi a una temperatura compresa tra 14 e 18 gradi Celsius in un flacone di vetro con tappo a vite. Preparare l'agarosio elettroforetico al 2% in 100 millilitri di mezzo di coltura 1 x. Autoclavare per sciogliere l'agarosio e utilizzare il forno a microonde per liquefare nuovamente l'agarosio quando necessario, mantenendolo in forma liquida.

Versare circa 0,5 millilitri sul fondo di ogni pozzetto di una piastra da coltura sterile da 24 pozzetti. Questo impedirà agli impianti di attaccarsi alla plastica. Quindi versare circa due-tre millilitri sul fondo di due piastre Petri da 360 millimetri e agitare delicatamente per distribuire il liquido in modo uniforme.

Questi serviranno come capsule per dissezione e l'aros impedisce che gli embrioni si attacchino alla plastica. Una volta rimossi i loro membrane, quando l'aros si sarà raffreddato e indurito, passare la fiamma sulla punta di una pipetta pastorale lunga sei pollici finché non si scioglie formando una sfera. Raffreddare brevemente la sfera, quindi toccare leggermente la superficie dell'aros in una pozzetta della piastra di coltura.

Questo creerà una depressione superficiale in cui verrà posizionato l'X explan. Ripetere per ogni pozzetto della piastra. Successivamente, riempire ogni pozzetto della piastra di coltura con un millilitro di un x mezzo di coltura sterile.

Quindi riempire la piastra per dissezioni con MBS 0,1 X per facilitare la separazione dei blastomeri. Una volta preparate le piastre per dissezioni, trasferire le uova fecondate prive di mantello gelatinoso in piastre di Petri da 100 millimetri contenenti mezzo di coltura 0,5 x. Le uova che non vengono utilizzate immediatamente possono essere coltivate a 14 gradi Celsius mentre si esamina la prima piastra alla ricerca di embrioni a due cellule.

Esaminare gli embrioni nella prima piastra di Petri utilizzando un microscopio stereoscopico; con una pipetta di trasferimento in plastica, trasferire circa 10 embrioni a una e due cellule in una piastra separata contenente mezzo di coltura 0,5 x. Posizionare la piastra di Petri in un incubatore a 14 gradi Celsius. L'efficacia di questo saggio nel valutare con precisione il potenziale di sviluppo di una cellula dipende dall'isolamento corretto della blastomera in base alle mappe del destino cellulare.

Pertanto, è fondamentale scegliere embrioni con il corretto modello di pigmentazione allo stadio a due cellule, che di conseguenza seguano schemi di segmentazione regolari. Come illustrato qui. Le segmentazioni regolari si verificano spesso solo su un lato dell'embrione.

Questi embrioni possono comunque essere utilizzati come donatori se la cellula donatrice proviene dal lato normale. Quando gli embrioni raggiungono lo stadio a due cellule, separare quelli in cui il primo solco di scissione divide a metà la zona leggermente pigmentata nell'emisfero animale e trasferirli in una piastra distinta; selezionare un numero di embrioni pari a circa cinque volte quello che verrà dissezionato. Questi embrioni saranno i donatori per l'esplan.

Mantenere i due embrioni a due cellule in una piastra separata accanto agli embrioni donatori per tutta la durata della procedura, in modo da utilizzarli come controlli fratelli per lo stadio dell'esplan. Dopo aver ordinato e dissezionato gli embrioni, tornare alle piastre nell'incubatrice per individuare ulteriori embrioni a una e due cellule. Poiché gli embrioni a una cellula impiegano circa 90 minuti per dividersi, questa operazione può essere effettuata fino a due ore dopo il prelievo delle uova.

Per preparare l'esplan, posizionare da cinque a dieci embrioni in una piastra per dissezione. Quindi posizionare il primo embrione in modo che la membrana vitellina trasparente possa essere afferrata con le pinzette. Di solito non è visibile, ma può essere afferrata al polo animale, dove è separata da uno spazio perivitellino chiaro sopra la superficie dell'embrione.

Utilizzando una pinzetta affilata in una mano, afferrare il campione a una certa distanza dal blaster che deve essere dissezionato, in modo da non danneggiarlo. Successivamente, con l'altra pinzetta affilata nell'altra mano, afferrare la membrana vicino alla punta dell'altra pinzetta e tirare delicatamente in direzioni opposte per staccare la membrana. L'embrione si appiattirà una volta rimossa la membrana.

Successivamente, afferrare una cellula adiacente con la pinzetta e utilizzare questa cellula come maniglia in modo che la cellula da dissezionare non venga toccata direttamente con la pinzetta nell'altra mano; tirare delicatamente le restanti cellule adiacenti lontano dalla blasfema desiderata. Se le cellule della linea mediana, che condividono lo stesso destino, sono quelle bersaglio, possono essere rimosse insieme come una coppia. Infine, dissezionare e rimuovere la cellula maniglia.

Prelevare la coppia blasfema o amere con una pipetta di vetro sterile, evitando bolle d'aria e aspirazione eccessiva. Posizionare la punta della pipetta sotto la superficie del mezzo di coltura in una pozzetta della piastra di coltura X explant e rilasciare delicatamente il blaster. Questo dovrebbe scivolare nella depressione superficiale per gravità.

Blasfemi provenienti da più di un embrione possono essere combinati in un singolo espianto depositandoli nella stessa depressione di una piastra di coltura. Ripeteremo questa procedura con i restanti embrioni nella capsula di dissezione, uno alla volta. Dopo circa 10 embrioni, la capsula di dissezione sarà piena di detriti cellulari.

Quando ciò si verifica, passare alla successiva piastra per dissezioni. Una volta completate tutte le dissezioni, verificare se gli esplantati si trovano nelle depressioni poco profonde. In caso contrario, possono essere delicatamente spostati all'interno della depressione utilizzando un anello di capello precedentemente sterilizzato in etanolo al 70% e fatto asciugare all'aria. Incubare gli impianti a temperatura ambiente sul banco per circa un'ora dopo l'ultima dissezione.

Rimuovere i detriti circostanti l'espianto guarito con una pipetta di vetro sterile. Incubare la piastra con l'espianto a 14-20 gradi Celsius accanto alla capsula di Petri contenente gli embrioni di controllo fratelli. Gli embrioni fratelli indicheranno la fase di sviluppo dell'espianto sperimentale.

Dopo circa una o due ore di coltura, i blastomeri espiantati si saranno divisi circa quattro volte e avranno eliminato la maggior parte dei detriti rimasti da cellule vicine danneggiate. Dopo 20 ore, formeranno piccole sferette compatte di cellule. Quando i gemelli raggiungono lo stadio di sviluppo desiderato, raccogliere l'espianto.

Questi esplantati sopravvivono abbastanza bene, anche se alcune cellule vanno incontro a disintegrazione. Pertanto, se nella coltura è presente una massa torbida, la esamineremo con un anello di capello o con pinzette per determinare se al suo interno è presente un espiantato sano. Prelevare l'espiantato in un piccolo volume di soluzione di coltura mediante una pipetta di vetro Pasteur ed espellerlo delicatamente in un fissativo o in un buffer di lisi appropriato per il saggio da eseguire.

Sono stati isolati due blastomeri dorsali o due blastomeri ventrali allo stadio a 16 cellule e coltivati in un singolo XMBS a 14 gradi Celsius fino a quando gli embrioni fratelli hanno raggiunto le fasi iniziali della piastra neurale. Ogni campione è stato analizzato per l'espressione della piastra neurale zigotica. Gene Sox due mediante ibridazione in situ, che appare come prodotto della reazione blu.

I risultati di questo saggio dimostrano che la maggior parte dei blastomeri animali dorsali, che sono precursori della piastra neurale, può esprimere autonomamente SOX2, ossia senza segnalazione aggiuntiva da altre regioni dell'embrione. Quei campioni che non esprimono SOX2 potrebbero essere stati identificati in modo errato al momento della dissezione.

Al contrario, nessuno dei blasfemi animali ventrali, che sono precursori dell'epidermide ventrale, esprime SOX2. Questi dati indicano che i blasfemi animali dorsali possiedono un'abilità intrinseca a formare tessuto neurale, mentre i blasfemi animali ventrali non la possiedono. Alcuni degli espian dorsali hanno inoltre assunto una morfologia indicativa della formazione del mesoderma dorsale.

Questi blastomeri inoltre si attenuano per formare il Noor nell'embrione integro e una coltura esplantata esprime una proteina marcatrice di Noor per verificare l'effetto della modulazione dei livelli endogeni di un gene neurale materno. Gli mRNA di Fox D cinque sono stati iniettati nei blastomeri precursori ventrali a otto cellule. Come mostrato qui, la maggior parte degli impianti ventrali ha espresso SOX due.

Al contrario, quando il livello endogeno di Fox D5 è stato ridotto mediante iniezione di oligonucleotidi morfolino antisenso nei precursori dorsali delle cellule a otto blastomeri, solo pochi espianati dorsali hanno espresso SOX2. Questi esperimenti indicano che l'espressione materna di Fox D5 svolge un ruolo nella capacità intrinseca dei blastomeri dorsali di acquisire un destino neurale prima di questa procedura. Altri metodi, come l'iniezione negli embrioni da dissezionare di mRNA per l'acquisizione di funzione o di oligonucleotidi morfolino antisenso per la perdita di funzione, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande.

Ad esempio, quali geni sono coinvolti nella capacità intrinseca delle cellule di assumere un particolare destino di sviluppo? Inoltre, è possibile testare fattori di segnalazione noti aggiungendo al mezzo di coltura fattori purificati. Questo approccio può essere utilizzato anche per trapiantare singole cellule in posizioni nuove all'interno dell'embrione intatto.

Questo test verifica se la cellula trapiantata è destinata a mantenere il suo originale destino di sviluppo; quest'informazione è fondamentale per definire i meccanismi cellulari attraverso cui una cellula embrionale pluripotente si impegna a diventare precursore di un tessuto definito.