Cut-loading: uno strumento utile per esaminare fino di accoppiamento Tracer Junction Gap tra i neuroni della retina
12 gennaio 2012
Un metodo semplice e pratico per determinare il grado di accoppiamento tracciante gap junction tra i neuroni della retina è descritta. Questa tecnica permette di studiare la funzione delle sinapsi elettrica tra i neuroni della retina intatta in condizioni di illuminazione diverse e in momenti diversi del giorno e della notte.
L'obiettivo generale del seguente esperimento di carico mediante incisione è esaminare il grado di accoppiamento tramite giunzioni comunicanti tra neuroni nella retina integra in condizioni controllate di illuminazione. Il primo passaggio consiste nell'incidere le retine con una lama affilata immersa in una soluzione di neurobiotina, una molecola tracciante in grado di diffondere attraverso i canali aperti delle giunzioni comunicanti, ma non attraverso le membrane cellulari. Nel secondo passaggio, le retine vengono incubate in soluzione di Ringer, che permette la diffusione del tracciante attraverso i canali aperti delle giunzioni comunicanti.
Se l'accoppiamento delle giunzioni a scambio è debole, la fluorescenza del biotina neuro sarà limitata ai neuroni retinici vicini al taglio. Al contrario, se l'accoppiamento delle giunzioni a scambio è forte, la fluorescenza sarà rilevata in neuroni retinici lontani dal taglio. Il principale vantaggio del caricamento mediante taglio rispetto alle tecniche esistenti è che è più facile da eseguire su neuroni con corpi cellulari piccoli in tessuto retinico neurale integro.
È inoltre più semplice controllare le condizioni di illuminazione durante il caricamento dei frammenti rispetto a uno studio elettrofisiologico di singoli neuroni in tessuto retinico integro. Poiché gli stimoli luminosi utilizzati durante la registrazione elettrica possono essi stessi indurre cambiamenti nel coupling delle giunzioni comunicanti, a dimostrare la tecnica sarà il dott. Chu Choi, un postdottorando del mio laboratorio. In questa procedura, un pesce rosso viene mantenuto al buio costante durante il giorno per almeno un'ora prima dell'intervento chirurgico, e tutti i passaggi successivi fino alla fissazione del tessuto retinico vengono anch'essi eseguiti durante il giorno in oscurità totale; anestetizzare profondamente il pesce rosso aggiungendo 150 milligrammi per litro di metanosulfonato all'acqua dell'acquario.
Quindi sacrificare il pesce rosso seguendo le linee guida federali e universitarie e rimuovere con cura i bulbi oculari. Successivamente, rimuovere la porzione anteriore di ciascun bulbo oculare. Poi posizionare un pezzo di carta da filtro sulla parte posteriore dell'occhio e capovolgere la carta da filtro e l'occhio in modo che la carta da filtro si trovi al di sotto della porzione posteriore dell'occhio.
Ora, rimuovere delicatamente la parte posteriore dell'occhio, compresa la sclera e l'epitelio pigmentato, dal pesce rosso adattato al buio. Tagliare il nervo ottico con un paio di forbici fini. La retina neurale del pesce rosso, con il lato dei fotorecettori rivolto verso l'alto, dovrebbe ora essere fissata alla carta filtro prima dell'enucleazione, mentre il pesce è in anestesia, con cinque millilitri di soluzione Ringer a base di carbonato ossigenata, con o senza farmaco in esame, aggiunti in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti, dopo la dissezione della retina neurale integra dalla porzione posteriore dell'occhio.
Trasferire le retine nelle pozzette durante l'oscurità costante. Quindi sigillare le pozzette con paraform e lasciare che il tessuto incubi per 30 minuti. Preparare 100 microlitri di soluzione tracciante sciogliendo il 0,5% di neuro biotina in soluzione di Ringer immediatamente prima di tagliare attraverso la retina.
Successivamente, aggiungere la soluzione di neuro biotina in una piastra di Petri di vetro. Poi, battere delicatamente il filtro di carta a cui è attaccata la retina su un tovagliolo di carta. Per rimuovere l'eccesso di ringer, immergere una lametta nella soluzione di neuro biotina ed eseguire un taglio radiale perpendicolare attraverso la retina e il filtro di carta.
Successivamente, immergere nuovamente la lametta nella soluzione di neuro biotina e tagliare la retina una seconda volta. Ripetere fino a quattro tagli per retina. In questo passaggio, trasferire la retina in una soluzione di ringer fresca, con o senza il farmaco in esame, per 15 minuti per consentire il caricamento e la diffusione.
Lavare tre volte con soluzione fisiologica fresca, mezzo con o senza farmaco in esame, per cinque minuti ciascuno. Quindi fissare la retina con paraformaldeide al 4% in soluzione tampone fosfato 0,1 M a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, lavare la retina con PBS 0,1 M durante la notte a quattro gradi Celsius, ponendola in frigorifero il giorno seguente.
Fare reagire la retina con streptavidina Alexa 488 al 2% in PBS 0,1 M e Triton X-100 allo 0,3% fino a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare la retina tre volte con PBS 0,1 M a temperatura ambiente, ogni volta per 10 minuti.
Staccare la retina dalla carta filtro in PBS. Quindi, utilizzando un pennello fine, montare la retina con il lato dei fotorecettori rivolto verso l'alto su un vetrino con del mezzo di montaggio Vector Shield. Trasferire il vetrino su un microscopio confocale a scansione laser ed acquisire immagini alla stessa risoluzione di ingrandimento e con le stesse impostazioni per ogni condizione sperimentale, in modo da poter effettuare confronti sugli effetti di diverse condizioni sperimentali sull'estensione del coupling funzionale tramite traccianti per giunzioni comunicanti, come mostrato.
Questo mostra il grado di accoppiamento tramite tracciante delle cellule fotoricettori durante il giorno in oscurità costante, rispetto al giorno in oscurità costante in presenza di un antagonista selettivo del recettore D2 della dopamina. Si noti che il taglio con il rasoio in entrambe le immagini è a sinistra. Sebbene una singola immagine possa contenere tutte le cellule marcate, si raccomanda di acquisire uno stack Z dell'area di interesse e di comprimerlo in un'unica immagine mostrata.
Di seguito è riportata l'estensione del trasferimento del tracciante nelle cellule fotoricettori man mano che si procede in successione attraverso un Zack di questo tipo. Si noti che il taglio con il rasoio in questa immagine si trova a destra. Per quantificare l'estensione del trasferimento del tracciante nel browser delle immagini LSM, aprire l'immagine, quindi fare clic su esporta e salvare l'immagine come file TIF a 16 bit non compresso; la barra di scala dovrebbe essere inclusa in questa immagine TIF utilizzando il software NIH Image J.
Misurare l'intensità di fluorescenza di neurobiotina marcata con Alexa 488 a partire da immagini a basso ingrandimento di retine montate su supporto circolare. Aprire il file TIFF utilizzando il software ImageJ, quindi tracciare una linea retta corrispondente alla barra della scala. Successivamente, andare su Analizza, Imposta scala e inserire la distanza nota e l'unità di lunghezza.
Quindi fare clic su OK. Ora le misurazioni della fluorescenza possono essere presentate in unità calibrate, come millimetri. Successivamente, selezionare l'area di interesse utilizzando lo strumento di selezione rettangolare.
Il picco della fluorescenza deve essere posizionato al bordo sinistro della selezione. Assicurarsi che non vi sia alcun segnale fluorescente vicino al bordo destro. Fare clic su analizza e traccia il profilo per i dati di controllo diurni ottenuti in oscurità costante.
Viene visualizzata una curva con un decadimento esponenziale da sinistra a destra. Quindi fare clic su copia nella finestra popup e incollarla in Excel. Ora sono presenti due colonne, una che mostra la distanza dal taglio e l'altra che mostra l'intensità di fluorescenza in funzione della distanza dal taglio.
Come confronto, i passaggi sopra indicati vengono ripetuti con dati ottenuti in oscurità costante durante il giorno. In presenza di spit bro, dividere ogni valore di fluorescenza grezzo per il valore massimo di fluorescenza per ottenere l'intensità relativa di fluorescenza. Copiare due colonne corrispondenti alla distanza dal taglio e all'intensità relativa di fluorescenza, quindi incollarle nel software Origin.
Questi passaggi vengono mostrati sia per il controllo diurno che per il campione diurno. A questo punto, analizzare i dati adattando i risultati con una funzione di decadimento esponenziale. Confrontare i valori della costante spaziale in diverse condizioni sperimentali utilizzando un test T o ANOVA.
Funzioni esponenziali e analisi statistiche dei dati di controllo diurni, di piprona diurna e di controllo notturno sono mostrate a scopo di confronto. Di seguito sono riportati esempi dell'estensione del coupling del tracciante nelle cellule fotoricettori nella retina del pesce rosso adattata al buio durante il giorno A, la notte B e durante il giorno in presenza di un antagonista selettivo del recettore D2 della dopamina, come rivelato dalla tecnica di carico mediante taglio. Tutte le immagini confocali sono state acquisite utilizzando le stesse impostazioni per permettere un confronto.
In questo grafico, l'intensità di fluorescenza per tre condizioni sperimentali è riportata in funzione della distanza dal taglio ed è stata adattata mediante una funzione esponenziale. La tecnica del carico mediante taglio viene utilizzata per quantificare il grado di accoppiamento tramite giunzioni comunicanti calcolando i valori della costante spaziale, come mostrato qui per tre condizioni sperimentali. La tecnica del carico mediante taglio può essere impiegata anche per studiare le sinapsi elettriche tra altri tipi cellulari nella retina e in altre specie.
Ad esempio, queste due figurelle illustrano che i neuroni orizzontali di tipo A e di tipo B nei conigli mostrano un accoppiamento omologo al tracciante dopo il caricamento mediante taglio e la diffusione di neurobiotina in condizioni di adattamento al buio. Abbiamo utilizzato la tecnica di caricamento mediante taglio per studiare l'estensione della diffusione del tracciante attraverso le giunzioni comunicanti tra bastoncelli e coni durante il giorno e la notte. Inoltre, questa tecnica può essere impiegata per determinare se l'accoppiamento al tracciante tra altri neuroni retinici è controllato dall'orologio retinico e/o da specifiche condizioni di luce e buio.
È inoltre possibile utilizzarlo per studiare il coupling tramite traccianti tra neuroni in altre regioni cerebrali.
Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per determinare il grado di accoppiamento tramite traccianti dei giunzioni a gap tra i neuroni retinici. La tecnica consente lo studio delle sinapsi elettriche nella retina integra in condizioni di illuminazione variabili.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia della retina
- Comunicazione cellulare
Sfondo
- Le giunzioni comunicanti facilitano la comunicazione tra neuroni.
- La comprensione del coupling con traccianti può fornire informazioni sul funzionamento neuronale.
- I metodi esistenti possono risultare difficili da applicare ai corpi cellulari di piccole dimensioni in tessuti integri.
- Le condizioni di illuminazione possono influenzare il coupling delle giunzioni comunicanti.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo pratico per valutare il coupling delle giunzioni a scalmo.
- Studiare gli effetti dell'illuminazione sulle sinapsi elettriche nei neuroni retinici.
- Migliorare le tecniche esistenti per lo studio di piccole strutture neuronali.
Metodi Utilizzati
- Le retine vengono sezionate e caricate con un tracciante neuro biotinico.
- L'incubazione in soluzione di Ringer permette la diffusione del tracciante.
- La fluorescenza viene analizzata per valutare l'intensità del coupling.
- Le condizioni sperimentali sono controllate per minimizzare influenze esterne.
Risultati principali
- L'intensità della fluorescenza indica il grado di accoppiamento del tracciante.
- I risultati variano in base alle condizioni di illuminazione e all'ora del giorno.
- Il caricamento mediante incisione si è dimostrato efficace per piccole strutture neuronali.
- Viene facilitata l'analisi comparativa tra diversi apparati sperimentali.
Conclusioni
- Il metodo di caricamento su tessuto è uno strumento utile per lo studio dei neuroni retinici.
- Le condizioni di illuminazione influenzano in modo significativo il coupling tramite giunzioni comunicanti.
- Questa tecnica può migliorare la nostra comprensione della comunicazione neuronale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La valutazione della comunicazione mediata da giunzioni a scambio nei neuroni retinici supporta la validazione del bersaglio nella scoperta di farmaci in neuroscienze, consentendo una riduzione del rischio meccanicistica degli agenti modulatori sinaptici. La tecnica di caricamento mediante incisione fornisce dati quantitativi sulla diffusione del tracciante con risoluzione spaziale in condizioni di illuminazione controllata, migliorando l'affidabilità predittiva negli studi iniziali di interazione con il bersaglio. Questo approccio supera un ostacolo tecnico fondamentale nello studio di piccole strutture neuronali in tessuto integro, facilitando lo sviluppo di saggi riproducibili per la chiarificazione delle vie coinvolte.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando il trasferimento del tracciante attraverso le giunzioni comunicanti come parametro funzionale dell'intensità sinaptica elettrica.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante misurazioni standardizzate della diffusione del tracciante, che chiariscono la modulazione del bersaglio da parte di neurotrasmettitori o farmaci.
- Valore predittivo: Facilita la selezione del portafoglio sperimentale fornendo valori quantitativi della costante di spazio che riflettono l'efficacia del coupling in diverse condizioni sperimentali.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Genera sistemi biologici validati (retine integre) con permeabilità delle giunzioni comunicanti adatta allo screening di composti successivi.
- Riproducibilità: Permette protocolli standardizzati di caricamento e diffusione del tracciante in condizioni di buio costante, riducendo la variabilità dovuta ai cambiamenti di conducibilità indotti dalla luce.
- Output quantitativo: Produce profili di intensità della fluorescenza che possono essere normalizzati ed adattati a modelli di decadimento esponenziale per il confronto tra diverse condizioni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Supporta l'indagine sulla regolazione circadiana delle giunzioni comunicanti nella retina, un meccanismo rilevante per i disturbi del processamento visivo.
- Continuità traslazionale: Collega la validazione del bersaglio nella fase di scoperta con la continuità preclinica, permettendo una valutazione costante del coupling del tracciante in condizioni di luce/buio.
- Decisioni basate sul rischio: Fornisce dati sugli effetti di modulatori (ad esempio, antagonisti del recettore D2) per orientare decisioni di avanzamento o interruzione in base a evidenze di interazione con il bersaglio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta consentendo la verifica di ipotesi sui modulatori dei giunzioni comunicanti prima dell'identificazione del capostazione, fornendo dati in uscita che informano direttamente sulla fiducia nel bersaglio e sull'analisi del percorso metabolico.
- Biologia della scoperta: Supporta la riduzione del rischio meccanicistico isolando l'effetto dell'illuminazione e di agenti farmacologici sulla diffusione del tracciante attraverso le giunzioni comunicanti.
- Screening: Fornisce preparazioni di tessuto pronte per il saggio con diffusione del tracciante quantificabile, supportando una valutazione affidabile degli effetti dei composti sul coupling neuronale.
- Analisi: Genera misurazioni calibrate dell'intensità di fluorescenza e della costante spaziale che permettono il confronto statistico (ad esempio, test T) della forza del coupling in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega a studi preclinici consentendo la valutazione della regolazione del coupling del tracciante da parte dell'orologio retinico e dei cicli luce/buio, rilevanti per modelli di malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo studio del coupling delle giunzioni comunicanti tra diversi tipi di neuroni retinici e specie, riducendo lo sviluppo metodologico ridondante.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione dell'obiettivo riducendo l'ambiguità meccanicistica nella comunicazione sinaptica elettrica.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità attraverso un'illuminazione controllata e procedure standardizzate di caricamento del tracciante.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo decisioni più precoci di proseguimento/cessazione basate su dati quantitativi sull'interazione con l'obiettivo.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per il rischio fornendo dati empirici sugli effetti dei modulatori in diverse condizioni temporali e farmacologiche.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione della retina, nella manipolazione dei traccianti e nella microscopia a fluorescenza in condizioni di buio controllato.
- È dipendente da strumentazione per il microtaglio, l'incubazione, l'immagine confocale e la quantificazione della fluorescenza (ad esempio, ImageJ, Origin).
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda i protocolli di illuminazione, la concentrazione del tracciante e la profondità del taglio, al fine di garantire misurazioni del coupling riproducibili.
- Richiede considerazioni di adattamento quando la tecnica viene applicata ad altri sistemi neuronali o specie con diverso spessore del tessuto e permeabilità delle giunzioni comunicanti.
- I limiti pratici includono la necessità di utilizzare traccianti permeabili come il neurobiotina e l'impossibilità di valutare direttamente le sinapsi elettriche non accoppiate al tracciante.
