Ibridazione in situ per la localizzazione precisa delle Trascrizioni nelle piante

L'obiettivo generale del seguente esperimento è visualizzare i modelli di espressione dell'mRNA a livello cellulare con elevata sensibilità e specificità. Questo risultato si ottiene innanzitutto sottoponendo sezioni di tessuto fissato in formalina e inclusi in paraffina a una serie di soluzioni per rimuovere la cera, permeabilizzare i tessuti e bloccare i gruppi minori carichi positivamente nei tessuti, che potrebbero generare un segnale di fondo. Successivamente, sonde di RNA marcate con DIG specifiche per il gene di interesse vengono infiltrate nelle sezioni di tessuto e i vetrini vengono ibridati per tutta la notte.

Successivamente, i vetrini vengono trattati con RNA. A per rimuovere la sonda legata in modo non specifico dalle sezioni e poi incubati con un anticorpo anti-DIG. Questo consente la visualizzazione della sonda ibridata mediante una reazione chimica colorimetrica.

I risultati mostrano un segnale blu scuro rilevabile mediante microscopia ottica specificamente nelle cellule del tessuto in cui è espressa la sequenza genica di interesse. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi di analisi dell'espressione, come la R-T-P-C-R, i micromatrici o le tecniche di sequenziamento di nuova generazione, è che il protocollo di ibridazione in situ qui presentato rivela il profilo di espressione di un gene di interesse nel suo contesto tissutale. Questi metodi comprendono numerose fasi che è preferibile apprendere attraverso dimostrazioni visive.

Mostreremo come sezionare e includere i tessuti, nonché i passaggi chiave del protocollo di ibridazione Al che risultano difficili da padroneggiare autonomamente. Il metodo di inclusione di tessuti fissati con paraformaldeide varia a seconda del tipo di tessuto da analizzare. Il punto più importante è garantire che i campioni siano orientati correttamente per il successivo sezionamento.

Un metodo di inclusione consiste nell'utilizzare stampi di plastica e anelli. Per iniziare questa procedura, riscaldare gli stampi su una piastra riscaldante a 60 gradi Celsius e quindi versare paraffina fusa negli stampi. Successivamente, utilizzare pinzette riscaldate per trasferire un campione di tessuto in ciascuno stampo e orientarlo nella posizione desiderata.

Spostare con attenzione lo stampo dalla piastra al banco e posizionare l'anello bianco sopra lo stampo. Aggiungere ulteriore mol e cera. Lasciare raffreddare e indurire gradualmente la cera prima di procedere al taglio in sezioni.

Riscaldare i blocchi a temperatura ambiente, quindi tagliarli in forma trapezoidale, lasciando circa un millimetro di paraffina intorno al campione. Posizionare il blocco tagliato sul microtomo in modo che la faccia più lunga delle due parallele sia in basso. Avanzare con attenzione il blocco verso la lama e assicurarsi che la superficie del blocco sia parallela alla sezione della lama.

Con uno spessore di otto-dieci micron. Allineare i nastri di paraffina su una superficie antiaderente, come carta d'alluminio, e selezionare le sezioni di interesse sotto un microscopio stereoscopico. Successivamente, contrassegnare i vetrini ProbeOn Plus con una matita.

Non utilizzare penne per i marcatori perché verranno cancellate durante il protocollo di ibridazione INI. Distribuire un millilitro di acqua milli Q pulita su ogni vetrino. Far galleggiare con attenzione le sezioni di interesse sulla superficie dell'acqua a temperatura ambiente.

Assicurarsi che il lato lucido sia rivolto verso l'acqua. Trasferire lentamente il vetrino su un riscaldatore per vetrini. Impostare la temperatura tra 35 e 37 gradi Celsius.

Questo intervallo di temperatura, a differenza dei comuni 42 gradi Celsius, impedisce la formazione di bolle sotto le sezioni. Dopo cinque minuti, versare con attenzione l'acqua in un unico movimento fluido in modo che il nastro venga abbassato sul vetrino. Lasciare asciugare i vetrini per almeno alcune ore o tutta la notte a 37 gradi Celsius affinché il tessuto aderisca e sia pronto per le sezioni istologiche.

Per ibridazione in situ, vengono dapprima deparaffinizzati e reidratati per la finalizzazione della deparaffinizzazione. Incubare i vetrini in due bagni di soluzione disincrostante per 10 minuti ciascuno. Per reidratare le sezioni di tessuto, far passare i vetrini attraverso una serie di concentrazioni decrescenti di etanolo per 30 secondi ciascuna.

Durante il trattamento con proteasi, che non viene mostrato in questo video, preparare una capsula di vetro con una soluzione di trietilammina 0,1 molare e posizionarla su un agitatore magnetico all'interno di una cappa chimica. Immediatamente prima di inserire il portavetrini metallico nella soluzione, aggiungere 1,25 millilitri di anidride acetica nella trietilammina, nel tampone e nel becco. Inoltre, preparare il sistema di fissaggio con morsetto e il supporto per tenere il portavetrini.

Ridurre la velocità della pinza Starr, fissare la rastrelliera con i vetrini sul supporto e abbassare la rastrelliera nella soluzione, mantenendola sollevata sopra la barretta magnetica. Continuare a mescolare lentamente per 10 minuti dopo aver sciacquato in PBS e averla nuovamente disidratata mediante una serie di etanoli. Le sezioni di tessuto sono pronte per l'ibridazione.

Posizionare i vetrini su una superficie pulita e lasciarli asciugare completamente all'aria per cinque-dieci minuti. Preparare la miscela tampone per l'ibridazione della sonda aggiungendo la sonda denaturata a 80 microlitri di tampone di ibridazione. Per ogni vetrino, miscelare accuratamente mediante pipettaggio, evitando la formazione di bolle.

Pipettare il tampone di ibridazione della sonda. Mescolare sul bordo destro del vetrino. Abbassare gradualmente un coprioggetto sul vetrino, assicurandosi che la soluzione di ibridazione ricopra tutte le sezioni senza formare bolle d'aria.

Toccare leggermente con il dito il coperchio del vetrino nel punto in cui si formano le bolle, per spostarle da tutte le sezioni di tessuto. Non staccare il coperchio del vetrino, poiché ciò danneggerebbe le sezioni. Posizionare i vetrini in una camera umida contenente carta Watman inumidita con acqua UE e parzialmente coperta con paraffina.

Chiudere ermeticamente la scatola e incubare i vetrini alla temperatura desiderata di ibridazione, tipicamente tra 50 e 55 gradi Celsius per 16-20 ore. Al termine del protocollo di ibridazione, rimuovere con attenzione le lamelle dai vetrini. La lamella potrebbe staccarsi spontaneamente quando il vetrino viene posizionato in posizione verticale, ma se così non fosse, non forzare il distacco della lamella poiché ciò danneggerebbe le sezioni.

Invece, immergere il vetrino in SSC 0,2 volte tiepido per uno o due minuti per lavare via il coprioggetto dopo aver rimosso i coprioggetti, quindi posizionare i vetrini su un portavetrini e lavarli più volte in SSC 0,2 volte a 55 gradi Celsius. Dopo il trattamento con RNAsi, trasferire i vetrini dal portavetrini sul fondo di una scatola di plastica piatta e coprirli con un volume minimo di soluzione bloccante. Bloccare i vetrini per 45 minuti a temperatura ambiente su una piattaforma agitata lentamente.

Successivamente, applicare un volume minimo di soluzione anticorpale direttamente su ciascun vetrino. Incubare i vetrini al buio per due o tre ore a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, trasferire i vetrini in una scatola pulita e piana e lavarli quattro volte con un volume minimo di tampone di lavaggio su una piattaforma agitata a temperatura ambiente.

Risciacquare i vetrini una volta in TBS e due volte in tampone TN prima di applicare la soluzione di colorazione appena preparata. Versare prima la soluzione di colorazione in una piccola capsula di bilancia in plastica. Quindi posizionare due vetrini uno sull'altro con le sezioni rivolte l'una verso l'altra.

Immergere il preparato nella soluzione, permettendo all'azione capillare di far risalire il liquido. Asciugare i vetrini su un fazzoletto di carta kimwipe. Riempire i vetrini con la soluzione di colorazione.

Di nuovo, potrebbe essere necessario battere leggermente sui vetrini mentre la soluzione entra per evitare bolle d'aria; posizionare quindi i vetrini in una scatola di plastica e conservarli a temperatura ambiente al buio. Qui vengono mostrati risultati rappresentativi ottenuti con diversi sonde e tessuti di arabidopsis. Il segnale viola fornisce una visualizzazione diretta, con risoluzione cellulare, del pattern di espressione del gene di interesse.

Il pannello A mostra la localizzazione dei trascritti di Meli one nella punta apicale vegetativa del fusto. Si noti la presenza di un segnale blu porpora nell'apice meristematico indeterminato e l'assenza di segnale nelle foglie circostanti. I pannelli B 2D sono sezioni di embrioni di arabidopsis allo stadio torpedine, in cui il pannello B mostra l'espressione di covata three nelle poche cellule staminali embrionali.

C mostra un'espressione di T ML one nello strato epidermico, mentre D mostra l'assenza di segnale in sezioni ibridate con un RNA di controllo negativo casuale. Queste immagini successive mostrano i risultati ottenuti con diverse sonde su tessuti di maze. Il pannello E mostra la localizzazione di STM Humalog knotted one nell'embrione di maze in via di sviluppo.

Si noti il forte segnale specificamente nel meristema embrionale e nelle sezioni longitudinali di radice attraverso l'apice della guaina vegetativa, che mostrano che ARF three A è espresso sulla superficie assiale inferiore della foglia nel pannello F e che l'omologo A T ML one OCL four è espresso specificamente nell'epidermide. Nel pannello G. Come previsto, nessun segnale di ibridazione è stato osservato per la sonda di controllo negativo nel pannello H. I risultati attesi dei diversi punti di controllo durante la trascrizione in vitro delle sonde sono mostrati qui. Le sonde per ibridazione in situ vengono controllate su un gel ARAZ standard dopo la trascrizione in vitro, dopo il trattamento con DNAasi e la successiva purificazione della reazione di trascrizione in vitro, dopo idrolisi al carbonato e quando sono pronte all'uso; per sonde di lunghezza superiore a 250 paia di basi, come la sonda uno, l'idrolisi al carbonato produrrà una gamma di frammenti di sonda più piccoli.

Questa figura mostra i risultati della qualificazione cromatica e metrica di sonde mediante analisi di diluizioni in dot blot, che vanno da 10 alla meno uno a 10 alla meno cinque di una sonda controllo a 100 nanogrammi per microlitro, e di tre sonde DIG appena etichettate, depositate su una membrana di trasferimento incubata con anticorpo anti-DIG e sottoposta al saggio. L'analisi suggerisce una concentrazione stimata di 100 nanogrammi per microlitro per la sonda due, 10 nanogrammi per microlitro per la sonda tre e 1 nanogrammo per microlitro per la sonda quattro, indicando che la sonda quattro difficilmente produrrà un buon segnale di ibridazione. Infine, queste sezioni longitudinali dell'apice della guaina vegetativa di Mace forniscono un confronto tra un segnale di fondo non specifico e un pannello di sonde funzionante.

A mostra un segnale di fondo non specifico, mentre il pannello B mostra un segnale specifico di ibridazione in situ con la sonda OC five nello strato cellulare esterno. Dopo aver visto questo, dovreste avere una chiara comprensione di come eseguire molte delle fasi complesse dei protocolli di ibridazione iniziale, in modo da poter determinare i precisi modelli temporali e spaziali di espressione dei vostri geni di interesse.