Radioattivo In situ Ibridazione per il rilevamento Diversi schemi di espressione genica nei tessuti

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare le regioni di espressione genica specifica e caratterizzare i tempi e i livelli di espressione genica al fine di contribuire alla comprensione della funzione genica. Ciò si ottiene raccogliendo e preparando rapidamente il tessuto da utilizzare nella procedura, preservandone l'integrità. Come secondo passaggio, il tessuto viene trattato per ridurre il legame di fondo delle sonde ribonucleotidiche.

Successivamente, le sonde ribo vengono ibridate con il tessuto e il legame della sonda RIBA viene visualizzato. L'utilizzo di pellicole a raggi X o di emulsioni sensibili alla luce consente di ottenere risultati che mostrano la localizzazione e il livello di espressione genica in base a immagini a raggi X o all'analisi mediante microscopia in campo chiaro e in campo scuro. Utilizzando il software Image J, ci sono diversi passaggi critici che devono essere eseguiti correttamente e che spesso vengono sbagliati; uno di questi è la prevenzione del fondo.

Esistono diversi passaggi che possono generare rumore di fondo, come una fissazione inadeguata o un'ibridazione a temperatura non corretta. Un altro fattore è la contaminazione da RNA, che degrada la sonda di RNA. Pertanto, è necessario prestare attenzione a mantenere tutto privo di RNAsi.

E il terzo punto è che, quando le vetture vengono immerse nell'emulsione, è necessario assicurarsi che non vi siano fughe di luce nella stanza buia o esposizione all'emulsione durante tutte le fasi del processo, che può durare fino a tre settimane. A dimostrare questa tecnica sarà Hun Chen, un ricercatore postdottorato nel mio laboratorio. Dopo aver prelevato un cervello fresco e averlo risciacquato una volta in PBS, incorporare il cervello in un mezzo OCT Tissue-Tek immergendo il cervello in uno stampo contenente il mezzo a temperatura ambiente.

Assicurarsi che il cervello sia orientato correttamente per il sezionamento. Successivamente, dopo aver spruzzato l'anidride carbonica solida con etanolo, congelare il tessuto posizionando il blocco nella miscela di etanolo e anidride carbonica solida. Con attenzione a non far entrare l'etanolo all'interno del blocco, sezionare il tessuto congelato in sezioni spesse da 10 a 12 micron utilizzando un criostato e montarle su vetrini super plus per tessuto cerebrale e tessuto embrionale.

La temperatura ottimale di taglio è compresa tra meno 18 gradi Celsius e meno 20 gradi Celsius. Conservare le sezioni in una scatola porta-oggetti a meno 80 gradi Celsius. Trasferire gli oggetti porta-oggetti dallo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius su un supporto metallico in ghiaccio secco.

Quindi, lavorando in una cappa certificata, posizionare il supporto in una soluzione di paraformaldeide al 4% preriscaldata di tre-cinque gradi Celsius rispetto alla temperatura ambiente. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente; al termine dell'incubazione, rimuovere il supporto dalla paraformaldeide e lavare i vetrini immergendo il supporto in PBS per 15 volte. Ripetere questo passaggio di lavaggio due volte, utilizzando ogni volta una soluzione fresca di PBS.

Successivamente, immergere i vetrini in un bagno di acetilazione appena preparato per 10 minuti per ridurre il legame non specifico della sonda RIBA. Quindi lavare i vetrini come in precedenza, ma questa volta utilizzando SSPE due volte come soluzione di lavaggio. Disidratare il tessuto mediante una serie di etanolo al 70, 95 e 100% per due minuti in ciascuna soluzione.

Quindi asciugare le lamelle in cappa per almeno da 10 a 15 minuti. Dopo aver sintetizzato la sonda RIBA, in base alle istruzioni riportate nel protocollo scritto, calcolare il volume richiesto di sonda RIBA e di soluzione di ibridazione necessario per tutte le lamelle. Riscaldare preventivamente la miscela di ibridazione con la sonda Ribo a 65 gradi Celsius per cinque minuti.

Per denaturare la sonda Ribo, pipettare 100 microlitri della soluzione di ibridazione della sonda Ribo e allinearla sul vetrino coprioggetto. Quindi utilizzare un secondo vetrino coprioggetto per distribuire uniformemente la soluzione sul tessuto e sul vetrino. Posizionare il vetrino in posizione orizzontale e rivolto verso l'alto in una griglia metallica e, una volta pronti tutti i vetrini, immergere lentamente la griglia in un bagno d'olio a 65 gradi Celsius per un minimo di quattro ore e un massimo di 16 ore.

L'olio crea una sigillatura ermetica attorno alle lamelle dopo l'incubazione; rimuovere l'eccesso di olio dalla griglia metallica contenente i vetrini. Quindi posizionare la griglia in un contenitore di vetro o metallo contenente cloroformio sotto cappa chimica. Ripetere il lavaggio utilizzando un secondo contenitore con cloroformio fresco.

Successivamente, immergere il supporto in una soluzione di 0,1% betta me cap in etanolo più SSPE 2x per allentare le lamelle e sciogliere la soluzione di ibridazione in eccesso. Trasferire quindi i vetrini in una seconda soluzione fresca di 0,1% betta me cap in etanolo più SSPE 2x. Posizionare i vetrini senza lamella in un supporto nuovo all'interno di una vaschetta contenente 0,1% beta macca TER etanolo in SSPE 2x, incubando questa soluzione per un'ora a temperatura ambiente per rimuovere la sonda a RNA marcata in eccesso non legata.

Quindi trasferire il supporto dei vetrini nella soluzione pre-riscaldata di SSPE 2× contenente il 50% di soluzione principale per ampie superfici a 65 gradi Celsius, aggiungendo beta-ME (captoetanolo) a una concentrazione finale dello 0,1%, e incubare a 65 gradi Celsius per un'ora. Al termine dell'incubazione, scartare questa e tutte le precedenti soluzioni di lavaggio acquose, insieme ai coverslip, come rifiuto radioattivo. Successivamente, lavare i vetrini due volte in SSPE 0,1× pre-riscaldata a 65 gradi Celsius, per 30 minuti ciascuna.

Quindi disidratare il tessuto mediante una serie di etanolo al 70%, 95% e 100%, lasciando due minuti in ciascuna soluzione. Infine, asciugare i vetrini in una cappa per almeno 30 minuti. Prima di tutto, determinare se nel tessuto è presente un segnale radioattivo.

Posizionare i vetrini essiccati in una cassetta per pellicola, operando in una stanza oscura utilizzando una luce sicura; posizionare la pellicola radiografica sopra i vetrini. Assicurarsi che i vetrini siano rivolti verso il lato emulsione della pellicola, quindi chiudere la cassetta. Esporre i vetrini alla pellicola per uno a sette giorni, a seconda dell'abbondanza prevista dei trascritti.

Al termine dell'esposizione, sviluppare la pellicola a raggi X in un rivelatore standard e fissarla. Il segnale di ibridazione apparirà come aree nere sulla pellicola, risultanti dai granuli d'argento esposti nell'emulsione, vicino a determinare la risoluzione cellulare e per osservare il segnale stesso sul tessuto. I vetrini vengono immersi in un'emulsione fotografica e quindi controcolorati.

Se i vetrini devono essere controcolorati con violetto di cresile, allora le sezioni devono essere desincronizzate seguendo le istruzioni del protocollo scritto. A questo punto, lavorando in stanza buia, versare acqua distillata in un tubo. Prelevare l'emulsione uc NTB e diluire l'emulsione con acqua distillata in rapporto uno a uno.

Dopo aver sciolto l'emulsione in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius per 20-30 minuti, trasferirla in un contenitore di vetro per immersione posto in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius per 20-30 minuti. Il livello dell'emulsione diluita dovrebbe ora ricoprire tutte le sezioni su un vetrino quando quest'ultimo viene immerso. Se sono presenti molti vetrini, potrebbe essere necessaria una quantità aggiuntiva di emulsione.

Ora immergere i vetrini nell'emulsione diluita in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius, quindi asciugare i vetrini in un contenitore chiuso al riparo dalla luce, durante la notte in una stanza buia, oppure in un forno a 37 gradi Celsius per due o tre ore con le luci spente. Dopo l'essiccazione, trasferire i vetrini in una scatola per vetrini. Sigillare i bordi con nastro isolante nero e quindi ricoprirli con carta d'alluminio.

Conservare le lastre a quattro gradi Celsius per diversi giorni o settimane prima dello sviluppo; scaldare quindi le lastre a temperatura ambiente. Successivamente, lavorando in stanza buia, rimuovere dalla scatola il portavetrini contenente le lastre e svilupparle nel rivelatore codec D 19 a 16 gradi Celsius per tre-cinque minuti. Successivamente, lavare le lastre sviluppate in acqua corrente a temperatura ambiente per un minuto.

Quindi incubare i vetrini due volte nella soluzione fissante a 19 gradi Celsius per sei minuti ciascuna; le luci della stanza possono essere accese durante la seconda incubazione con il fissatore. Ora lavare i vetrini in acqua corrente a temperatura ambiente per almeno 30 minuti. Poi, utilizzando una lametta, raschiare l'emulsione dalla parte posteriore del vetrino mentre è ancora bagnato.

Infine, eseguire la colorazione di contrasto con violetto di cristallo allo 0,3%, quindi disidratare e montare i vetrini seguendo le istruzioni riportate nel protocollo scritto, se necessario. Rimuovere ulteriormente qualsiasi eccesso di emulsione sul retro dei vetrini bagnandoli con acqua e raschiando con una lametta. Risciacquare i vetrini in soluzione di etanolo all'80% e asciugarli delicatamente una o due volte per eliminare detriti e polvere.

Scattare immagini in illuminazione in campo oscuro o in campo chiaro. I passaggi di raschiatura e pulizia potrebbero dover essere ripetuti due o tre volte per ottenere immagini di buona qualità prive di particelle di polvere, che sono facilmente visibili in campo oscuro al microscopio stereoscopico. Le seguenti immagini sono esempi di autoradiografie di ibridazione in situ ottenute da pellicole a raggi X.

Questa immagine su pellicola a raggi X mostra una sezione sagittale dell'intera testa del passero zebra, un uccello canoro, al giorno embrionale 10, ibridata con una sonda riboprobe antisenso per Fox P1. I granuli neri visibili sulla pellicola indicano l'espressione dell'mRNA, che come si può osservare nei quattro principali compartimenti cerebrali, risulta arricchita nel mesoalio striato e nel talamo dorsale. L'immagine della pellicola a raggi X mostra una sezione dello stesso passero zebra ibridata con la sonda RIBA da 90 centesimi per Cuper.

TF due Co.TF due è arricchito nella regione dell'alium palatum e nella parte più ventrale del talamo. Le seguenti immagini sono esempi di autoradiografia di ibridazione in situ ottenute da vetri coprioggetti trattati con emulsione. Questa immagine in campo scuro, acquisita al microscopio stereoscopico, mostra una sezione sagittale dell'intera testa di un fringuello zebra al sesto giorno dopo la schiusa, ibridata con una sonda RIBA senso inverso per Fox P uno.

I granuli argentati bianchi esposti nell'emulsione sopra il tessuto mostrano l'espressione dell'RNA messaggero. Il colore rosso rappresenta la colorazione con violetto di kreosolo. La barra della scala rappresenta un millimetro.

Qui l'immagine mostra una sezione dello stesso uccello canoro, il fringuello zebra, ibridata con una sonda riboprova antisenso per Coop TF due. Le immagini seguenti confrontano l'etichettatura antisenso e senso, che mostra diversi pattern nell'autoradiografia su pellicole a raggi X di sezioni del cervello di fringuello zebra prelevate al giorno embrionale 12. La linea tratteggiata indica il contorno dell'intero cervello e la C indica il cervelletto.

Si può osservare che il filamento antisenso di PAC sei è espresso nel cervello, in particolare nella zona ventricolare. La sezione adiacente ibridizzata con il filamento senso di PAC sei non mostra espressione di fondo in tutta la testa dell'embrione, ma una chiara espressione nello strato pigmentato della retina, contrariamente al filamento antisenso. Le seguenti immagini mostrano in C due segnali di espressione genica e diapositive ricoperte di emulsione ottenute dal cervello del fringuello zebra durante le fasi embriologiche avanzate, osservate in campo chiaro e in campo scuro.

Questa immagine in campo chiaro mostra l'espressione di D one B al giorno embrionale 10. Da un'esposizione normale all'emulsione, l'etichetta che appare nera è a malapena visibile a questo ingrandimento. Questa immagine mostra una sezione e un ingrandimento identici a quelli della precedente immagine, ma in vista in campo scuro, in cui l'etichettatura appare bianca nello striato e nel talamo.

Questa immagine in campo chiaro mostra l'espressione di slit tre all'undicesimo giorno embrionale. Dopo un'eccessiva esposizione all'emulsione, l'etichetta nera è facilmente visibile. SC indica la posizione del midollo spinale e CB indica la posizione del cervelletto.

La parte rostrale è orientata a sinistra. L'immagine mostrata qui corrisponde alla stessa sezione, con un'ingrandimento identico, ma visualizzata in campo scuro, in cui l'etichettatura appare in bianco nel midollo spinale, corrispondente all'immagine in campo chiaro. Le immagini seguenti mostrano la risoluzione dei granuli argentici a livello cellulare.

Qui è mostrato l'etichettamento del messenger RNA di Fox P1 nei granuli d'argento nel proencefalo del fringuello zebra; i granuli d'argento appaiono come puntini neri sopra le cellule colorate con violetto di cresta. Questa immagine mostra un'espressione ad alta abbondanza su singole cellule nel mesoalio del fringuello zebra adulto. Questa immagine mostra un'espressione a bassa abbondanza su singole cellule nell'alio adiacente della stessa sezione qui.

Ciao Fox. L'espressione dell'RNA messaggero P1 è visibile nelle cellule all'interno del mesenchima all'12° giorno embrionale.

Le cellule embrionali visibili in questa immagine sono più piccole e più strettamente impacchettate rispetto alle cellule adulte mostrate nelle due immagini precedenti. Infine, questa immagine mostra un'espressione a bassa abbondanza sulle cellule nell'alium adiacente della stessa sezione. Dopo aver seguito questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'immunochimica, per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio in quale tipo cellulare viene espressa la sequenza genica bersaglio.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'ibridazione in situ. Non dimenticare che lavorare con reagenti radioattivi può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale devono essere sempre adottate durante questa procedura.