Costruzione di un laser a basso costo del sistema assotomia per studiare la rigenerazione assonale nel C. elegans

L'obiettivo generale di questa procedura è mostrare come assemblare e allineare un sistema di ablazione laser per lo studio della rigenerazione degli assoni nei *C. elegans*. Questo viene realizzato montando innanzitutto un laser, un polarizzatore, una lamina a mezzo onda, uno specchio deviatore, un periscopio, un binario e uno specchio del binario su un basamento ottico. Il passaggio successivo della procedura consiste nell'allineare il fascio laser con il fascio in uscita dalla lente condensatrice del microscopio.

Quindi viene montata, allineata e posizionata la lente espansore del fascio laser, in modo da centrare il fascio e renderlo a divergenza nulla. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'allineare perfettamente il punto di ablazione laser con il fuoco dell'immagine mediante regolazioni fini. In definitiva, è possibile tagliare con precisione assoni di mezzo micron con danni collaterali minimi ai tessuti, utilizzando un fascio laser limitato dalla diffrazione quando l'allineamento XY NC è imperfetto.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i laser al femtosecondo, è che è relativamente economica, con un costo di 15.000. È inoltre relativamente priva di manutenzione e consente un taglio degli assoni molto preciso. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla rigenerazione degli assoni del *Caenorhabditis elegans*, può essere applicato anche ad altri sistemi, come mosce, zebrafish, topo, sistema nervoso periferico e cellule in vitro.

Fondamentalmente, qualsiasi cellula situata entro 30-50 micrometri dalla superficie. Iniziare posizionando i componenti sul breadboard e fissare con bulloni il periscopio laser e i supporti rialzati del binario. Questo sistema utilizza un laser di Classe tre B che può facilmente danneggiare gli occhi; pertanto, si prega di prendere molto seriamente le precauzioni di sicurezza per l'uso del laser.

Parli con qualcuno del dipartimento di fisica del suo ateneo su come utilizzare in sicurezza i laser a fascio libero. Durante l'allineamento, imposti sempre il laser alla potenza più bassa possibile. Quando osserva attraverso gli oculari, si assicuri che il laser sia chiuso meccanicamente e che il laser sia spento.

Ora, posizionare prima il microscopio, allineandolo con l'asse della rotaia. In secondo luogo, allinearlo con il fascio di luce trasmessa proveniente dalla lente condensatrice del microscopio. In terzo luogo, allineare entrambe le estremità della rotaia con il fascio del condensatore utilizzando un diaframma regolabile o una lente fissata alla rotaia.

Utilizzare un livello e dei supporti regolabili per aggiustare l'altezza del binario prima di procedere. Assicurarsi che entrambe le estremità del binario siano allineate. A questo punto, verificare che il fascio laser passi attraverso la guida, il polarizzatore di Thompson e la lamina a mezzo onda, senza colpire i bordi durante la rotazione.

La piastra intermedia regolerà la potenza del laser con tutti i componenti fissati al basamento. Accendere il laser, impostare la frequenza d'impulso a 100 in modalità continua e ridurre al minimo la potenza utilizzando la piastra intermedia. Utilizzare un foglietto adesivo o carta per lenti per visualizzare il fascio laser.

Ora bisogna elevare il fascio laser dal piano ottico. Regolare e fissare in sequenza gli specchi montati cinematicamente, partendo dal laser, per indirizzare il fascio verso lo specchio montato all'estremità della guida rialzata. Al termine, il fascio laser dovrebbe essere allineato approssimativamente al centro degli specchi, e gli specchi dovrebbero essere orientati ad un angolo di circa 45 gradi rispetto all'asse del fascio laser, prima di procedere all'allineamento del fascio laser con il fascio di luce trasmessa del microscopio.

Rimuovere o aprire eventuali filtri ND e diaframmi nel modulo intermedio. Ora iniziamo il passaggio più critico per ottenere un taglio preciso degli assoni senza danni collaterali eccessivi. Allineeremo il laser con precisione lungo gli assi x, y e z, utilizzando la potenza laser più bassa possibile per ottenere il punto di ablazione più piccolo.

I fasci del laser e della luce trasmessa possono essere visti contemporaneamente su un foglio di carta. Posizionare il foglio vicino all'uscita del microscopio per iniziare. Procedere ora all'allineamento del laser utilizzando le regolazioni grossolane dello specchio in cima al periscopio e dello specchio all'estremità del binario.

Posizionare un foglio di carta tra la lente del condensatore allineata e la torretta dell'obiettivo aperta. Continuare a utilizzare le regolazioni fini dello specchio del binario per allineare il fascio laser al centro del fascio di luce trasmessa più ampio. A questo punto, fissare il microscopio in posizione con delle morse.

Ulteriori passaggi per la valutazione dell'allineamento del laser sono disponibili nel manoscritto scritto. È necessario installare espansori del fascio galileiani doppi per ampliare il fascio laser da 300 micron di 33 volte, in modo da riempire l'apertura posteriore dell'obiettivo da 10 millimetri. Iniziare montando le quattro lenti sui portaelenti.

Quindi fissare le lenti sul binario in modo che siano tutte sullo stesso asse ottico e perfettamente ortogonali al fascio laser. Accendere il laser e regolarlo alla potenza minima e in modalità continua. Regolare approssimativamente l'allineamento del fascio attraverso ciascuna lente.

Utilizzare un foglio di carta per visualizzare il fascio. Spegnere ora il laser. Applicare uno scudo di sicurezza al laser e rimuovere il microscopio dal percorso del fascio laser.

Riaccendere il laser e visualizzarlo contro una parete vicina. Utilizzare la regolazione fine delle lenti per espandere il fascio. Quindi regolare gli ultimi due specchi montati cinematicamente per allineare il fascio in un cerchio di luminosità uniforme nella posizione stimata della diaframma posteriore dell'obiettivo.

Verificare le dimensioni e l'uniformità del fascio su un foglio di carta. Quindi regolare il fascio a convergenza zero osservando come le dimensioni del fascio cambiano quando il foglio viene spostato a distanza maggiore dalla lente. Spegnere il laser e attivare l'otturatore meccanico.

Far scorrere il microscopio nuovamente nel percorso del fascio laser utilizzando le morse fisse per definire l'allineamento corretto. Sostituire le morse sul lato libero del microscopio, ma non serrare completamente. Accendere ora il laser.

Rimuovere lo scudo di sicurezza e ruotare la torretta degli obiettivi su una posizione aperta utilizzando un foglio di carta sul portapreparati; un fascio laser espanso e uniforme, centrato sul fascio di luce trasmessa proveniente dal condensatore, dovrebbe essere visibile. Se non è centrato, centrare i fasci allentando le morse del microscopio e spostando con attenzione il microscopio. Ora inserire lo scudo di sicurezza e impostare il laser in modalità di attivazione.

Ruotare l'obiettivo da 60 volte in posizione. Ora acquisire l'immagine dei graffi superficiali su un vetrino bersaglio. Rimuovere lo sportello di sicurezza, attivare il laser di ablazione e regolare la potenza del laser per ottenere il minimo spot di ablazione.

Il punto deve essere circolare e posizionato entro cinque a dieci micron dal centro dell'immagine, ovvero il punto di ablazione. Utilizzando le regolazioni fini dello specchio di guida montato cinematicamente per mantenere il punto centrato e il profilo del fascio uniforme, sarà necessario regolare in modo iterativo lo specchio montato sulla guida e lo specchio superiore del periscopio. Valutare la messa a fuoco Z del laser spostando sistematicamente il fuoco verso l'alto e verso il basso a passi di un micron, attivando il laser di ablazione a ogni passo.

Se il fascio è correttamente espanso e allineato, con una convergenza adeguatamente regolata, allora dovrebbe ablare al massimo nel fuoco dell'immagine e debolmente o per nulla a un micron sopra o sotto il fuoco. Se il punto di ablazione massima si trova sopra o sotto il fuoco dell'immagine, effettuare le regolazioni finali del fuoco Z del fascio espanso spostando la lente L3 del telescopio galileiano finché l'ablazione laser non risulti congruente con il fuoco dell'immagine. I nematodi sono stati montati su un vetrino personalizzato e gli assoni sono stati ablati utilizzando il sistema costruito di Laser exo somy; l'acquisizione di immagini in time-lapse della rigenerazione assonica è risultata molto robusta.

Utilizzando uno stadio motorizzato, è stato possibile sezionare e acquisire regolarmente e con precisione cinque assoni in cinque animali diversi, su un singolo vetrino. Il tempo di acquisizione per gli assoni era il fattore limitante.

Circa il 10% degli esperimenti ha prodotto filmati in time-lapse di alta qualità. I restanti esperimenti hanno comunque fornito dati buoni, ma erano esteticamente meno gradevoli a causa di piccoli movimenti oscillatori del verme, che in genere iniziavano dopo cinque-otto ore di immobilizzazione. Durante l'esecuzione di questa procedura, è sempre fondamentale valutare con precisione l'allineamento del laser lungo gli assi x, y e Z.

Il problema più comune che le persone incontrano quando tentano di tagliare un assone è il danno collaterale o l'incapacità totale di tagliare gli assoni, e ciò è quasi sempre dovuto a un laser mal allineato. Questo sistema di ablazione laser e la tecnica per la visualizzazione della rigenerazione assonale in c Agains ti permetteranno di analizzare sistematicamente l'effetto di qualsiasi mutazione genetica sulla rigenerazione dell'assone. NCL Agains.