Rilevazione multiplex di batteri in campioni clinici complessi ed Ambientali con oligonucleotidi accoppiati microsfere fluorescenti
23 ottobre 2011
Descriviamo un metodo multiplex per la rilevazione di microrganismi in un campione con oligonucleotide ad accoppiamento perline fluorescenti. Amplificato da tutti gli organismi in un campione è ibridato ad un pannello di sonda-perline accoppiate. Uno strumento Luminex o Bio-Plex è usato per interrogare ogni perla per il tipo di perline e segnale di ibridazione.
Ciao, sono Tim Duso di Agriculture and AgriFood Canada. In questo video, illustreremo un protocollo per determinare la presenza e l'abbondanza di microorganismi specifici in un campione clinico o ambientale complesso, utilizzando uno strumento Bio-Plex. Questo protocollo impiega microsfere di polistirene fluorescenti che sono chimicamente legate a una sonda oligonucleotidica specifica per specie.
Un amplicone viene generato dal campione utilizzando primer PCR universali e l'amplicone viene ibridato con sonde accoppiate a microsfere. Vengono generati due segnali con lo strumento Bio-Plex: uno identifica la microsfera e l'altro quantifica il segnale di ibridazione.
L'obiettivo generale della procedura è determinare un profilo della microflora di interesse in modo rapido e semiquantitativo. Abbiamo applicato questa tecnica per determinare profili batterici in tamponi vaginali e utilizzato i dati ottenuti per diagnosticare la vaginosi batterica, una condizione clinica caratterizzata da un cambiamento della microflora in cui gli organismi del genere Lactobacillus diventano meno prevalenti e altri organismi come Gardnerella, Vais e Apoian Vae diventano rilevabili nei tamponi vaginali. È importante tuttavia tenere presente che questa tecnica può essere applicata a qualsiasi altra microflora per la quale sia desiderabile un saggio multiplex rapido.
Iniziamo descrivendo il funzionamento della procedura. Un profilo microbico viene generato amplificando un gene della proteina chaperonina 60 presente in tutti gli organismi presenti in un estratto di DNA del campione prelevato con tampone. Uno dei primer universali per l'amplificazione è modificato mediante l'aggiunta di biotina, nonché con l'inclusione di basi modificate con gruppi fosfato.
All'estremità cinque prime, l'amplificato viene reso a filamento singolo utilizzando l'esonucleasi T sette, che degrada soltanto il filamento antisenso. Poiché il filamento senso è protetto da un primer PCR modificato con fosfato, sonde oligonucleotidiche complementari al filamento rimanente vengono legate covalentemente a microsfere fluorescenti di polistirene. Poiché ogni colore unico di microsfera contiene una sonda specifica per un organismo diverso, fino a cento microsfere differenti possono essere utilizzate per un singolo campione.
Il prodotto PCR a singolo filamento proveniente dal tampone vaginale viene ibridato a una miscela di microsfere accoppiate a sonde contenenti le sonde per tutti gli organismi di interesse. Viene aggiunto un marcatore fluorescente FICO ethin che si lega alle sonde biotinilate attraverso un coniugato strep din. Infine, la miscela di ibridazione viene analizzata mediante uno strumento Luminex o Bio Plex, che esamina ogni microsfera singolarmente per identità e segnale di ibridazione.
I risultati di questa analisi indicano la presenza di microorganismi specifici e l'intensità del segnale di ibridazione è correlata all'abbondanza di tale organismo. Nel campione, la presenza di organismi associati alla vaginosi batterica può essere utilizzata per diagnosticare la BV. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la colorazione di Gram, è che vengono ottenute informazioni sulla presenza di microorganismi specifici e sulla loro abbondanza.
La procedura sarà dimostrata da Jennifer Town, assistente di ricerca nel nostro laboratorio. Ri-sospendere le microsfere mediante vortex per circa 20 secondi. Trasferire 400 microlitri di microsfere in una provetta da centrifuga e centrifugare a 14.000 × g per un minuto, quindi rimuovere e scartare il soprannatante. Ri-sospendere le microsfere in 50 microlitri di MES 0,1 M a pH 4,5.
Aggiungere un'ammino di oligo di cattura alle microsfere e mescolare mediante vortex. Aggiungere 2,5 microlitri di soluzione fresca di EDC alle microsfere. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 30 minuti al buio.
Scartare la soluzione di EDC preparata in precedenza e preparare un nuovo campione di 10 milligrammi per millilitro di EDC in acqua. Come indicato sopra, aggiungere altri 2,5 microlitri di soluzione fresca di EDC alle microsfere e vortexare per cinque secondi. Incubare nuovamente a temperatura ambiente per 30 minuti al buio.
Lavare le perle aggiungendo un millilitro di Tween 20 allo 0,02%, vorticare per risospendere le perle e centrifugare a 14.000 ×g per un minuto; rimuovere e scartare il soprannatante. Lavare nuovamente le perle aggiungendo un millilitro di SDS allo 0,1%. Risospendere le perle in 100 microlitri di tampone TE.
Contare le perline in un emocitometro per determinare la concentrazione stock. Preparare una miscela madre di microsfere diluendo ogni perla a una concentrazione finale di 100 perle per microlitro nel pool di tampone; raggruppare le perline coniugate in base al plex desiderato del saggio. Conservare la miscela madre di microsfere a quattro gradi al buio. Questa miscela può essere conservata per mesi se mantenuta in queste condizioni; generare il prodotto PCR per ogni campione.
Aggiungere immediatamente dopo il completamento della PCR il set di primer modificati con fosfato e biotina all'estremità cinque prime. Aggiungere due microlitri di esonucleasi T7 a ogni provetta PCR e incubare a temperatura ambiente per 40 minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere 12,5 microlitri di E-D-T-A a pH 8,0 0,5 molar in mix.
Questo fornisce un totale di circa 64,5 microlitri di prodotto PCR a singolo filamento. Ripesare il master mix di microsfere Resus Bend con una pipetta. Distribuire una quantità appropriata in un tubo einor.
Chiudere il tubo e sottoporlo a sonificazione in un bagno a ultrasuoni per due minuti. Distribuire 17 microlitri di prodotto PCR a singolo filamento nelle pozzette appropriate di una piastra 96 pozzetti bassa. Aggiungere 33 microlitri di miscela di perle sonicate sospese in ciascuna pozzetta.
Copriremo la piastra con un coperchio in silicone e batteremo leggermente. Posizionare delicatamente la piastra nel termociclatore con un programma di 95 gradi per cinque minuti, 60 gradi per 10 minuti, mantenimento o pausa a 60 gradi per cinque minuti. Fine, avviare il programma.
Preparare una soluzione fresca di streptomicina, adenovirus, FICO e etina. Saranno necessari 25 microlitri per pozzetto. Preparare streptomicina e FICO etina diluendo il ceppo a un milligrammo per millilitro.
Uno da 50 a 20 microgrammi per millilitro con un volume di tampone tmac 1x. Quando il termociclatore raggiunge il passaggio di mantenimento a 60 gradi, aprire il coperchio, rimuovere il coperchio in silicone e aggiungere direttamente in ciascun pozzetto la soluzione di streptavidina-FICO etina. Sostituire il coperchio in silicone, chiudere il coperchio del termociclatore e riprendere il programma.
Al termine del programma, rimuovere la piastra e trasferirla rapidamente sul lettore Bio Plex per la lettura. La piastra deve essere letta entro 10 minuti. Leggere la piastra a 60 gradi.
Assicurarsi che il bioripartitore sia stato preriscaldato a questa temperatura. Vengono mostrati i risultati delle colorazioni di Gram e dei profili Luminex corrispondenti a campioni longitudinali provenienti da un singolo individuo al tempo zero. La colorazione di Gram è compatibile con una diagnosi clinica di vaginosi batterica (bv), confermata da un saggio Luminex pentaplex che evidenzia segnali positivi di ibridazione per organismi associati alla bv, inclusi Gardnerella, Atopobium e Prevotella.
Lactobacillus iners viene anche rilevato a livelli bassi man mano che il tempo progredisce. Questo individuo passa da una microbiota associata alla vaginosi batterica (BV) a una microbiota normale, come mostrato dalle colorazioni di Gram. L'analisi con Luminex di questi stessi campioni mostra che l'abbondanza di Gardnerella vaginalis raggiunge un picco e poi diminuisce, mentre Lactobacillus iners aumenta fino a diventare l'organismo dominante al tempo finale.
Utilizzando questo metodo per il profilo della microflora, si ottengono informazioni sulla presenza di organismi specifici e sulla loro abbondanza. Poiché il metodo è basato sulla sequenza, la progettazione delle sonde può avvalersi di analisi di sequenziamento profondo, consentendo di tracciare nei campioni i microrganismi identificati mediante metodi di sequenziamento di nuova generazione in modo rapido e relativamente economico. La visione di questo video dovrebbe avervi fornito una buona comprensione di come generare un profilo microbico da un campione utilizzando uno strumento Luminex o Bio Plex.
Vi abbiamo mostrato come accoppiare sonde di oligonucleotidi a microsfere fluorescenti, generare un amplicon a singolo filamento da un campione clinico o ambientale, eseguire l'ibridazione e determinare i risultati mediante uno strumento Luminex o Bio Plex. Buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per il rilevamento di microorganismi in campioni complessi mediante perline fluorescenti accoppiate a oligonucleotidi. Il metodo utilizza uno strumento Bio-Plex per analizzare i segnali di ibridazione provenienti dalle perline.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Diagnostica clinica
- Scienze ambientali
Sfondo
- Il rilevamento di microrganismi è fondamentale in diversi settori.
- I metodi tradizionali possono richiedere molto tempo ed essere meno specifici.
- Questo metodo migliora la specificità e la sensibilità.
- Le microsfere fluorescenti consentono capacità di multiplexing.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo rapido ed efficiente per la rilevazione di microrganismi.
- Utilizzare sonde oligonucleotidiche per garantire specificità.
- Dimostrare l'applicazione dello strumento Bio-Plex in questo contesto.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di microsfere di polistirene fluorescenti accoppiate a sonde specifiche per specie.
- Generazione di amplificati mediante primer PCR universali.
- Ibridazione degli amplificati con microsfere accoppiate a sonde.
- Analisi del tipo di microsfera e del segnale di ibridazione mediante uno strumento Bio-Plex.
Risultati principali
- Rilevamento con successo di microrganismi multipli in un singolo saggio.
- Quantificazione dei segnali di ibridazione dimostrata.
- Protocollo validato sia per campioni clinici che ambientali.
- Elevata specificità e sensibilità ottenute con il metodo.
Conclusioni
- Il metodo multiplex è efficace per il rilevamento di microrganismi.
- L'utilizzo di sonde oligonucleotidiche aumenta la specificità.
- Lo strumento Bio-Plex è uno strumento prezioso per questa analisi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il rilevamento multiplex mediante microsfere fluorescenti accoppiate a oligonucleotidi consente un profilo rapido e semi-quantitativo di comunità microbiche complesse in campioni clinici e ambientali. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nella diagnostica microbica fornendo risoluzione a livello di specie e dati sull'abbondanza, sostenendo punti critici di svolta nella ricerca traslazionale e nello sviluppo di saggi. La sua scalabilità e adattabilità lo posizionano come piattaforma riutilizzabile per la sorveglianza microbica e la validazione degli obiettivi su tutta la linea di prodotti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi delle variazioni della comunità microbica rilevanti per i meccanismi delle malattie e la verifica di ipotesi terapeutiche.
- Supporta la validazione funzionale dei bersagli quantificando l'abbondanza di organismi specifici in campioni complessi.
- Facilita la riduzione del rischio biologico mediante la rilevazione ad alta specificità di taxa clinicamente rilevanti.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi di rilevamento multiplex validati per flussi di lavoro diagnostici e di screening successivi.
- Fornisce profili microbici standardizzati, riproducibili e semi-quantitativi per il confronto degli saggi.
- Consente un'espansione scalabile per rilevare fino a 100 organismi per campione, supportando il riutilizzo della piattaforma.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea alle strategie traslazionali dei biomarcatori monitorando longitudinalmente le modifiche microbiche associate alla malattia.
- Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, permettendo la progettazione rapida di sonde informate dalla sequenza.
- Riduce l'ambiguità meccanicistica nei modelli di malattia fornendo dati sull'abbondanza specifica per organismo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questa piattaforma multiplex integra l'intero processo, dalla fase iniziale di scoperta fino all'identificazione dei composti promettenti e alla ricerca traslazionale, supportando analisi microbiche guidate da ipotesi e la prontezza dei saggi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi analizzando la composizione e l'abbondanza della microbiota.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili per confronti affidabili tra campioni e condizioni.
- Analisi: Fornisce l'intensità del segnale di ibridazione come lettura quantitativa dell'abbondanza degli organismi.
- Ricerca traslazionale: Consente il monitoraggio longitudinale di biomarcatori microbici rilevanti per le malattie.
- Riutilizzo aziendale: Adattabile a diversi tipi di campioni e bersagli microbici, supportando un'ampia utilità nella ricerca e sviluppo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e la validazione degli obiettivi consentendo il rilevamento a livello di specie in campioni complessi.
- Valore operativo: Standardizza e amplia il profiling microbico multiplex per applicazioni ad alto rendimento.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e riduce i rischi in fasi avanzate fornendo dati microbici utilizzabili.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione adeguata al rischio di programmi diagnostici e terapeutici rivolti a condizioni associate al microbioma.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella progettazione di sonde molecolari e nei flussi di lavoro basati sulla PCR.
- Necessita dell'accesso a strumentazione Luminex o Bio-Plex e a infrastrutture analitiche adeguate.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra gruppi di lavoro riguardo a set di sonde e condizioni del saggio, per garantire la riproducibilità.
- È adattabile a diversi tipi di campioni clinici e ambientali, con una personalizzazione appropriata delle sonde.
- È limitato dalla necessità di informazioni di sequenza per guidare la progettazione delle sonde e dal rischio di cross-reattività in comunità altamente diverse.
