Visualizzazione di Caenorhabditis Elegans Strutture cuticola Utilizzando il Dye lipofili Vital, Dii
30 gennaio 2012
Vi presentiamo un metodo per visualizzare in vivo cuticola C. elegans Con il colorante rosso fluorescente lipofile DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato), che viene comunemente usato in C. elegans Per visualizzare l'ambiente neuroni esposti. Con questo protocollo ottimizzato, le strutture e le ali anulare cuticolare sono macchiati da DII e osservate al microscopio composto.
L'obiettivo generale di questo procedimento è visualizzare l'esoscheletro nei nematodi marini trasparenti e vivi utilizzando il colorante lipofilico fluorescente rosso dye eye. Questo viene ottenuto preparando una popolazione di nematodi per la colorazione. Successivamente, il colorante dye eye viene aggiunto in forma diluita alla popolazione e lasciato incubare.
Successivamente, gli animali vengono recuperati dalla soluzione di colorazione. L'immagine di fluorescenza del tegumento colorato con Dai mostra dettagli sulla superficie, inclusi le strutture riproduttive oculari di Ailey e Ann e altre caratteristiche morfologiche esterne. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti per la visualizzazione del tegumento in questo organismo trasparente, come l'imaging diretto, la fluorescenza, l'espressione di transgeni, la colorazione con anticorpi, la microscopia elettronica e il germe di grano marcato con agglutinina, è che questa tecnica è facile da eseguire, relativamente rapida ed economica, e fornisce un'ottima risoluzione delle strutture cuticole in animali vivi.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali in molti settori che utilizzano il sistema modello *C. elegans* e il suo tegumento, come la secrezione cellulare e l'organizzazione del tegumento, lo sviluppo delle cellule epidermiche, i percorsi genici eterocronici, l'immunità innata, lo sviluppo di caratteri morfologici e l'evoluzione dei nematodi. A dimostrare la procedura sarà Robbie Schultz, uno studente laureato del mio laboratorio. Quando si lavora con *C. elegans*, tenere presente che è sensibile alla luce.
Proteggere sempre l'occhio D dalla luce avvolgendolo nella stagnola. Indossare inoltre guanti e camice da laboratorio poiché il DMF è tossico e il DAI è un cancerogeno. Il cianuro Dai è molto potente.
Un diluizione di lavoro a concentrazione standard è di 30 microgrammi per millilitro di DII in M nine, e una singola popolazione richiede soltanto 400 microlitri di diluizione di lavoro. Iniziare con una piastra da 60 millimetri popolata da nematodi non contaminati. Lavare gli animali dalla piastra con 1,5 millilitri di Triton X 100 allo 0,5%.
Nel buffer M nine, ruotare delicatamente il liquido con movimenti circolari per staccare tutti gli animali larvali e adulti, quindi trasferire il lavaggio in un tubo da 1,5 millilitro. Centrifugare immediatamente gli animali a 2000 RRP M per 30 secondi per raccoglierli sul fondo del tubo. Rimuovere il più possibile il soprannatante senza disturbare gli animali.
Procedere con attenzione, senza essere troppo avidi. Lavare gli animali con un millilitro di M nine. Centrifugare e rimuovere il sopranatante.
Ripetere il lavaggio. Centrifugare nuovamente ed eliminare il soprannatante. Successivamente, aggiungere 400 microlitri di Dai a 30 microgrammi per millilitro in M9 nel tubo.
Vortexare brevemente il tubo per risospendere gli animali. Quindi agitare il tubo a 20 gradi Celsius in posizione orizzontale per tre fino a 16 ore a 350 RP M in un ambiente protetto dalla luce. La tempistica di questi ultimi passaggi è importante.
Prima di tutto, il Triton X deve essere lavato via prima che rimuova i lipidi a cui si lega il dai. In secondo luogo, gli animali devono essere colorati nella soluzione di colorante per occhi a sufficienza da permettere una colorazione uniforme della cuticola. Poco dopo, gli animali dovrebbero essere lasciati riprendere sul cibo a sufficienza per rimuovere l'occhio non legato.
Al termine della colorazione, centrifugare gli animali ed eliminare la soluzione di colorante. Lavare gli animali con un millilitro di M nine. Per rimuovere il colorante non legato, centrifugare nuovamente gli animali ed eliminare il soprannatante.
Risospendere gli animali in 400 microlitri di tampone M9 e versarli su una porzione libera da batteri di una piastra microscopica NGM. Dopo aver seminato OP50 E. coli, lasciare che gli animali si riprendano al buio per almeno 30 minuti, ma non più di un giorno, poiché la fluorescenza del colorante si attenua durante il tempo di recupero. Gli animali dovrebbero spostarsi strisciando dal liquido di colorazione verso il cibo.
Questi animali sono più facili da immagine poiché presentano una fluorescenza di fondo minore derivante dal colorante libero nell'occhio. Iniziare preparando un pad di agar su un vetrino per garantire uno spessore uniforme del pad di agar utilizzato. Due distanziatori.
Uno spaziatore viene realizzato sovrapponendo due pezzi di nastro adesivo da laboratorio su un vetrino. Gli spaziatori possono essere utilizzati all'infinito. Successivamente, posizionare un vetrino pulito longitudinalmente tra due vetrini spaziatori e aggiungere circa 150 microlitri di agarosio fuso al 4%.
Al centro del vetrino pulito. Coprire rapidamente l'AER fuso con un ulteriore vetrino posizionato perpendicolarmente sopra l'AER e entrambi gli spaziatori per formare un cuscinetto di agar. Rimuovere con attenzione il vetrino coprioggetto, mantenendo il cuscinetto centrato sulla parte superiore del vetrino di montaggio.
Ora pipettare cinque microlitri di anestetico per nematodi sul vetrino, posizionare dallo otto al dodici animali nell'anestetico e coprire delicatamente con un coprioggetto per microscopio. Osservare gli animali utilizzando un microscopio composto o confocale dotato di un obiettivo di almeno 40x e di un filtro trissy o di un altro filtro compatibile. Il massimo di eccitazione fluorescente del colorante eye è di 549 nanometri e il suo massimo di emissione è di 565 nanometri.
Per campioni fissati, l'imaging rappresenta la parte più complessa di questo protocollo. Illustreremo come montare gli animali per l'imaging, ma è necessario aver ricevuto un'adeguata formazione sull'uso del microscopio composto o confocale che si intende utilizzare. Abbiamo riscontrato che l'utilizzo di un obiettivo con un ingrandimento di almeno 60 x è il migliore per risolvere i dettagli evidenziati mediante il metodo di colorazione.
Ognuna delle immagini in questa sezione è stata acquisita utilizzando un obiettivo 63x in C. elegans embrionico posteriore. La superficie della cuticola presenta solchi circonferenziali separati annualmente e, in alcuni stadi, creste longitudinali chiamate ailey. Ognuna delle immagini in questa sezione è stata acquisita con un obiettivo 63x in C. elegans post-embriogenico.
La superficie della cuticola presenta anelli annuali separati da solchi circonferenziali e, in alcuni stadi, creste longitudinali chiamate aley. Ogni stadio dello sviluppo presenta strutture cuticolari con composizioni e modelli distinti, e sia le creste che i solchi degli aley e degli Aly vengono colorati in modo fluorescente, a seconda della composizione della superficie.
Durante tutte le fasi larvali e adulte utilizzando questo metodo di colorazione in sospensione, essi rimangono visibili fino a un giorno dopo il recupero. A volte si osservano granuli fluorescenti di fondo, ma non in modo abituale. Questa è la cuticola di animali adulti mutanti che mostrano difetti moderati nell'organizzazione della cuticola.
Le creste di Ailey sono discontinue e sovranumerarie. Le creste di Ailey sono fuse e ramificate o biforcute, un marcatore transgenico comune. Un allele dominante di roll six provoca una torsione della cuticola, che può essere osservata nell'ailey e può causare un pattern irregolare degli anelli.
Dai colora anche altre strutture del cuticolo esterno, inclusi il vulva dell'adulto ermafrodita e la coda del maschio adulto; inoltre, dai può evidenziare difetti sottili nella morfologia esterna, come questa coda forcellata, causati da una colorazione insufficiente. Ad esempio, una colorazione di due ore porta a una colorazione cuticolare irregolare, sebbene i neuroni esposti all'ambiente possano essere colorati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore, esclusa l'acquisizione delle immagini, se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come colorare C. elegans con il colorante dieye per l'osservazione del cuticolo e di altre strutture morfologiche esterne.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per visualizzare la cuticola in C. elegans vivi utilizzando il colorante lipofilico fluorescente rosso DiI. Il protocollo ottimizzato consente l'osservazione di alae e strutture cuticolari anulari mediante microscopia composta.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Tecniche di imaging
Sfondo
- La visualizzazione del tegumento in organismi trasparenti è essenziale per lo studio della morfologia.
- I metodi esistenti includono l'immagine diretta e la colorazione con anticorpi.
- Il DiI è comunemente utilizzato per visualizzare i neuroni in C. elegans.
- Questo studio mira a migliorare la visualizzazione delle strutture cuticolari.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo semplice ed efficace per la colorazione della cuticola in C. elegans vivi.
- Migliorare la risoluzione dell'immagine della struttura cuticolare.
- Fornire un'alternativa economicamente vantaggiosa alle tecniche di visualizzazione esistenti.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di una popolazione di C. elegans per la colorazione.
- Incubazione dei nematodi in soluzione di colorante DiI diluito.
- Recupero degli animali dalla soluzione di colorazione.
- Acquisizione di immagini a fluorescenza per osservare i dettagli cuticolari colorati.
Risultati principali
- La colorazione con DiI evidenzia efficacemente le alae e le strutture anulari.
- L'immagine di fluorescenza rivela la morfologia dettagliata della superficie.
- Il metodo è rapido, facile da eseguire ed economico.
- I risultati dimostrano un'elevata risoluzione delle strutture cuticole in animali vivi.
Conclusioni
- Questa tecnica offre un vantaggio significativo rispetto ai metodi tradizionali.
- Permette una visualizzazione dettagliata delle caratteristiche cuticolari in C. elegans vivi.
- Il metodo può essere ampiamente adottato per diverse applicazioni di ricerca.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
La visualizzazione delle strutture cuticolari in C. elegans vivi permette di ridurre i rischi meccanicistici legati ai percorsi di sviluppo epidermico e di organizzazione della cuticola. Questo metodo supporta la validazione degli obiettivi fornendo letture fenotipiche quantitative per perturbazioni genetiche e farmacologiche. L'approccio offre una previsione affidabile nella fase iniziale di scoperta, collegando la morfologia della cuticola a modelli di motilità, immunità innata e evoluzione dei nematodi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative all'organizzazione del collagene della cuticola e allo sviluppo delle cellule epidermiche.
- Valore operativo: Fornisce un saggio solido e riproducibile per la validazione funzionale di bersagli in modelli di malattia basati su nematodi.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio collegando i difetti della cuticola a tratti morfologici e a vie geniche eterocroniche.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce letture fluorescenti ad alta risoluzione di anelli, ala, vulva e strutture della coda per lo screening di composti.
- Valore operativo: Offre un protocollo di colorazione rapido, economico e scalabile, compatibile con flussi di lavoro di imaging su animali vivi.
- Prontezza del saggio: Genera output morfologici standardizzati e quantificabili per la validazione dei risultati positivi e l'identificazione di composti promettenti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega la visualizzazione della cuticola a modelli preclinici di immunità innata e disturbi dello sviluppo.
- De-risking meccanicistico: Permette l'osservazione di difetti cuticolari in mutanti, supportando l'allineamento di biomarcatori per l'integrità epidermica.
- Sistema rilevante per le malattie: Applicabile a studi sull'evoluzione dei nematodi e sullo sviluppo di tratti morfologici rilevanti per lo screening di parassiticidi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test dell'ipotesi sul bersaglio allo screening fenotipico e alla validazione preclinica, consentendo un'affinamento iterativo di composti modulatori della cuticola.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi di organizzazione del tegumento e della secrezione epidermica attraverso la visualizzazione diretta delle perturbazioni strutturali.
- Screening: Fornisce una colorazione pronta per il saggio e riproducibile, con output di imaging quantitativi per la valutazione dell'effetto dei composti.
- Analisi: Offre letture basate sulla fluorescenza dell'integrità del tegumento, consentendo confronti statistici tra diverse condizioni genetiche o trattamenti.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta alla continuità preclinica visualizzando le strutture del tegumento associate a fenotipi di motilità e immunità.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging riutilizzabile per studi longitudinali della dinamica del tegumento attraverso stadi dello sviluppo e contesti genetici diversi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nei percorsi legati alla cuticola.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione, riproducibilità e scalabilità tra diversi laboratori mediante un protocollo semplice ed economico.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo consentendo un rilevamento precoce di segnali di tossicità o efficacia mediati dalla cuticola.
- Impatto sul portafoglio: Facilita la priorizzazione dei composti in base al rischio, considerando la gravità e la reversibilità del fenotipo della cuticola.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia a fluorescenza e nel manipolaggio di animali vivi.
- Necessita dell'accesso a microscopi composti o confocali dotati di set di filtri appropriati (eccitazione 549 nm, emissione 565 nm).
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda la durata della colorazione, i passaggi di lavaggio e le condizioni di recupero, al fine di ridurre al minimo la variabilità.
- Comporta la necessità di adattamenti per diverse ceppi di C. elegans e stadi di sviluppo, a causa della diversa composizione del tegumento.
- Comprende limitazioni pratiche, come il fotoblecamento del colorante durante il recupero e la possibile fluorescenza di fondo derivante dal colorante non legato.
