Diretto Cellular Self-Assembly di fabbricare Cell-Derived Anelli tessuto per l'analisi biomeccanica e di ingegneria dei tessuti

L'obiettivo generale di questa procedura è creare costrutti tridimensionali di tessuto a partire da cellule aggregate e matrice derivata dalle cellule, che possono essere utilizzati per analisi funzionali. Questo viene realizzato innanzitutto fresando uno stampo in policarbonato per creare pozzetti anulari con fondo rotondo. Successivamente, il poli dimetil silossano o PDMS viene colato sullo stampo in policarbonato per creare un modello.

Quindi, il modello in PDMS viene utilizzato per formare pozzetti aros. L'ultimo passaggio consiste nell'inoculare le cellule nei pozzetti aros, consentendo loro di aggregarsi e formare anelli di tessuto coesivi. In definitiva, questo metodo può essere impiegato per ottenere l'autoassemblaggio cellulare e l'ingegneria tissutale utilizzando diversi tipi cellulari, e permette l'analisi del contributo delle cellule e della matrice extracellulare da esse derivata alla struttura e alla funzione del tessuto.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri approcci di ingegneria tissutale è che possiamo generare costrutti tissutali interamente da cellule e dalla matrice extracellulare che esse producono più rapidamente di quanto riportato in precedenza, e in un formato favorevole all'analisi meccanica. Iniziare fresando un pezzo di policarbonato spesso mezzo pollice per creare 15 pozzetti anulari con fondo arrotondato e un perno centrale di due millimetri di diametro. Pulire lo stampo di policarbonato per rimuovere eventuali residui di plastica generati durante la fresatura e lasciare asciugare lo stampo. Successivamente, mescolare il PDMS in un rapporto 10 a 1 di base e agente indurente. Degasare la soluzione per rimuovere tutte le bolle d'aria e quindi versarla nello stampo di policarbonato.

Quindi disgasare nuovamente la miscela sullo stampo per rimuovere eventuali bolle d'aria residue e polimerizzare il PDMS in un forno a 60 gradi Celsius per quattro ore. Mentre il PDMS polimerizza, sciogliere il 2%AROS in DMEM. Una volta completata la polimerizzazione, rimuovere con attenzione lo stampo in PDMS staccandolo lentamente dal policarbonato, quindi lavare il PDMS con sapone e acqua e sterilizzarlo in autoclave insieme alla soluzione di DMEM con AROS. Posizionare ora lo stampo in PDMS sterilizzato in autoclave su una superficie piana e riempirlo con AROS fuso, pipettando prima l'AROS negli stampi dei perni centrali e successivamente pipettando l'AROS nello spazio circostante.

Lasciare solidificare gli aros per circa 15 minuti. Quindi capovolgere lo stampo per rimuovere gli aros dal PDMS. Tagliare gli eccessi di aros attorno a ciascun pozzetto, quindi posizionare un pozzetto di aros in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Ora.

Aggiungere il mezzo di coltura cellulare attorno all'esterno del pozzetto aros senza coprirne la parte superiore. Successivamente, posizionare le piastre nell'incubatore per consentire l'equilibrazione mentre vengono preparate le cellule. A confluenza del 90%, trattare con tripsina le cellule muscolari lisce aortiche di ratto e risospendere.

Sospendere le cellule a una concentrazione di cinque volte 10 alla sesta cellule per millilitro. Quindi pipettare 100 microlitri della sospensione cellulare risospesa in ciascun pozzetto dell'aro equilibrato. Utilizzare un movimento circolare per applicare le cellule in ciascun pozzetto.

Posizionare le piastre nell'incubatrice e lasciarle indisturbate per 24 ore. Cambiare il mezzo ogni due giorni aspirando il liquido attorno al pozzetto e quindi ricaricando ogni pozzetto fino a quando lo stampo aros non è completamente sommerso. Al termine della coltura, riempire una piccola capsula di Petri con PBS.

Rimuovere ogni anello dal suo stampo aros facendolo scivolare sopra la parte superiore del perno centrale. Posizionare gli anelli nelle piastre di Petri con PBS Center, un anello sotto il sistema di imaging digitale. Utilizzare un software di rilevamento dei bordi per misurare lo spessore dell'anello in quattro posizioni: superiore, inferiore, sinistra e destra lungo la sua circonferenza.

Per eseguire un test di trazione uniassiale, montare un campione ad anello su due morsetti costituiti da fili sottili. Estendere i morsetti fino a quando sul campione ad anello viene applicato un carico di strappo di cinque millinewton.

Quindi inserire l'area della sezione trasversale calcolata a partire dalle misurazioni dello spessore e registrare la lunghezza di riferimento. Sottoporre l'anello a otto cicli preliminari tra il carico di strappo e 50 chilopascal. Applicare sollecitazione a una velocità di 10 millimetri al minuto dopo l'ottavo ciclo preliminare, fino a rottura a 10 millimetri al minuto.

Per ogni anello, misurare lo sforzo di trazione ultimo e la deformazione di rottura e calcolare il modulo tangente massimo a partire dai dati acquisiti. Oltre agli studi funzionali in vitro, questi anelli cellulari viventi possono anche fondersi per formare tubi di tessuto. Utilizzare forbici chirurgiche per tagliare le estremità dei tubi di silicone con un angolo, creando bordi smussati, quindi sterilizzare i tubi di silicone in autoclave mentre i tubi vengono sterilizzati in autoclave.

Riempire una piastra di Petri con il mezzo di coltura, trasferire sterilizzati in biosicurezza dei supporti personalizzati in silicone per tubi in una cappa a sicurezza biologica e posizionarli in una piastra di Petri vuota. Successivamente, rimuovere gli anelli dalle camere aros e posizionarli nella piastra di Petri contenente il mezzo di coltura. Collocare i tubi in silicone nella stessa piastra di Petri per inumidirli prima dell'uso.

Utilizzare una pinzetta per posizionare l'estremità di un tubo di silicone al centro di un anello e far scorrere delicatamente l'anello lungo il tubo di silicone. Far scorrere gli anelli a contatto l'uno con l'altro spingendoli delicatamente in successione in entrambe le direzioni lungo il tubo. Una volta montati gli anelli, allineare i tubi di silicone all'interno dei supporti in policarbonato e avvitare insieme le due parti del supporto.

Aggiungere 55 millilitri di mezzo alla piastra di Petri. Cambiare il mezzo ogni tre giorni per tutta la durata della coltura, al fine di rimuovere i tubuli tessutali. Inizialmente, riempire una piastra di Petri con PBS.

Quindi rilasciare i tubi di silicone dal supporto in policarbonato e utilizzare la pinzetta per far scivolare i tubi di tessuto dal tubo di silicone e inserirli nella piastra. Se eseguita correttamente, la sedimentazione delle cellule avviene nei fondi delle pozzette di Aros e, entro 24 ore dal posizionamento, avviene una contrazione che genera un anello di tessuto attorno al perno centrale nella pozzetta di Agarro. Questo è un grafico rappresentativo di una curva sforzo-deformazione ottenuta da un test di trazione uniassiale su un anello di tessuto di due millimetri generato da cellule muscolari lisce di ratto. La resistenza a trazione massima, il modulo di trazione massimo e i valori di deformazione a rottura vengono quindi utilizzati per confrontare le proprietà meccaniche di campioni di anelli di tessuto coltivati in diverse condizioni di coltura.

Le proprietà meccaniche degli anelli di tessuto possono essere controllate modificando i parametri di coltura, tra cui il numero di cellule seminate, la durata della coltura, il mezzo di coltura e il tipo di cellule utilizzato. Oltre alle cellule muscolari lisce di ratto, le cellule muscolari lisce primarie umane formano anelli di tessuto con una resistenza a trazione simile.

Anche le cellule staminali mesenchimali umane si aggregano formando anelli, ma non erano abbastanza resistenti per i test meccanici. Il nostro sistema consente la fabbricazione di costrutti di tessuto ingegnerizzato interamente a partire da cellule, semplicemente seminando le cellule nei nostri pozzetti aros personalizzati. Una volta realizzato il modello iniziale in policarbonato, possiamo produrre un numero illimitato di stampi in PDMS che possono poi essere utilizzati per creare i modelli, senza richiedere ulteriore attrezzatura.

Il sistema è versatile poiché abbiamo utilizzato diversi tipi cellulari all'interno del sistema per creare anelli di tessuto, e pertanto questo sistema potrebbe essere impiegato potenzialmente sia per applicazioni di ingegneria tissutale sia per studi in vitro dei contributi delle cellule e della matrice extracellulare alla struttura e alla funzione del tessuto.