Un metodo semplice per l'imaging Arabidopsis Foglie Utilizzando Perfluorodecalin come Media Imaging infiltrativa

L'obiettivo generale di questa procedura è ridurre al minimo il degrado delle immagini biologiche causato dagli spazi aeriferi nelle foglie delle piante, al fine di ottenere immagini più nitide delle cellule vive all'interno della foglia. Se la foglia viene montata in un mezzo di montaggio acquoso e un fluorocromo viene eccitato da un laser, molti spazi aeriferi non riempiti e i cambiamenti nell'indice di rifrazione all'interno del tessuto, mostrati in arancione, limitano l'intensità del segnale in profondità all'interno del tessuto nell'immagine risultante. Se invece la foglia viene montata in perfluorodimetilcicloesano (PFD), l'eccitazione laser del fluorocromo risulta meno attenuata e consente una migliore trasmissione dei segnali emessi.

In definitiva, l'utilizzo della microscopia confocale a scansione con il mezzo di montaggio PFD consente di ottenere immagini chiare di cellule vive all'interno della foglia della pianta a una profondità superiore al doppio rispetto a quella ottenibile con un mezzo di montaggio acquoso. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la fissazione o il montaggio delle foglie con mezzi acquosi, è che riduce la rifrazione all'interno del mesofillo, permettendo un'analisi più accurata di cellule vive poste più in profondità nella foglia, aspetto che in precedenza risultava problematico. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella scienza delle piante, come lo studio del mesofillo, della biologia cellulare e della segnalazione in vivo, della colonizzazione delle foglie da parte di patogeni e delle interazioni tra patogeni e mesofillo, fornendo comunque informazioni approfondite sulla biologia vegetale di base.

È inoltre applicabile ad altri tessuti altamente refrattivi ricchi di spazi aerei, come le spirali insetto o il polmone dei vertebrati. A dimostrare questa procedura sarà il dottor George Littlejohn del mio laboratorio To Mount Leaf. La preparazione dei campioni in PFD inizia predisponendo un vetrino da microscopio con una guarnizione permeabile ai gas in poli dimetil silossano o P-D-M-S; il P-D-M-S è un polimero viscoelastico che può essere modellato per creare una camera adattata alle esigenze sperimentali.

Equilibrare il PFD con l'aria agitando un piccolo volume di PFD in una bottiglia piena d'aria. Questo può essere ottenuto anche facendo gorgogliare aria attraverso il PFD; successivamente, versare il PFD in una piastra di Petri aperta e far galleggiare un intero piantino o una foglia escissa sul liquido per cinque minuti. Il tessuto dovrebbe diventare traslucido, simile a un tessuto vitrificato.

Le foglie possono apparire più scure o più chiare rispetto a prima dell'esposizione al PFD, a seconda delle condizioni di illuminazione e dell'età del tessuto utilizzato. Infine, riempire la camera in PDMS con PFD aerato ed accuratamente trasferire i campioni di tessuto dalla piastra di incubazione alla camera in PDMS. Sigillare il vetrino con un coprioggetto ed eseguire l'acquisizione delle immagini.

In base ai requisiti sperimentali, le foglie sono state incubate per cinque minuti in una sospensione di proteina verde fluorescente ricombinante o GFP. Nell'ispezione microscopica in PFD di campioni di foglie incubati in PFD si osserva che la maggior parte degli spazi aeriferi è inondata dalla GFP ricombinante sospesa in PFD. La GFP appare in verde, mentre il rosso rappresenta la clorofilla, la fluorescenza del lotto e le cellule del mesofillo.

È evidente che la foglia viene inondata dopo l'incubazione con PFD, ma che possono rimanere occasionali sacche d'aria. In queste condizioni, l'acqua non inonda la foglia. Qui, foglie di opsys che esprimono Venus, una variante di YFP, localizzata nel citosol, vengono incubate e montate in aria, acqua o PFD per la scansione laser. La microscopia confocale dei campioni mostra un vantaggio del PFD rispetto all'aria e all'acqua, con un aumento approssimativo di due volte nella profondità di imaging.

Confrontando il PFD e l'acqua, una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque-dieci minuti se effettuata correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che il perfluorodecalina dissolve lo smalto per unghie e il teflon, ma è compatibile con la vaselina siliconica. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare il perfluorodecalina come mezzo di montaggio per migliorare l'immagine delle cellule delle foglie delle piante.

Non dimenticare che, sebbene il perfluorodecalina sia non tossico, si raccomanda di adottare le normali pratiche di sicurezza durante l'esecuzione di questa procedura.