Cella di analisi specifica di

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare una popolazione di protoplasti specifici per tipo cellulare da una foglia. Questo risultato si ottiene innanzitutto coltivando piante che esprimono GFP in tipi cellulari specifici della foglia. Il secondo passaggio consiste nel raccogliere le foglie e generare protoplasti mediante digestione enzimatica.

Successivamente, i protoplasti vengono filtrati e separati mediante citometria a flusso attivata da fluorescenza (FACS). L'ultimo passaggio consiste nel confermare l'accuratezza del frazionamento mediante microscopia a fluorescenza. Infine, i protoplasti purificati possono essere utilizzati per l'analisi dell'espressione genica specifica per tipo cellulare, per analisi proteomiche o per profili metabolici.

Il sorting cellulare attivato da fluorescenza è stato utilizzato con successo in precedenza per le radici, ma non per l'isolamento di cellule fogliari. L'etichettatura con GFP prima di questo metodo è stata limitata a causa dell'interferenza derivante dalla fluorescenza della clorofilla. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché una preparazione rapida ma accurata del campione è cruciale per minimizzare i cambiamenti fisiologici estesi che possono verificarsi durante il sorting cellulare.

Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà perché non sapranno come configurare l'ordinatore cellulare né come verificare un'ordinazione accurata. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia sistemica delle piante. Il problema nell'identificare le reti di regolazione genica in organi multicellulari complessi come una foglia è che diversi tipi cellulari esprimono gruppi differenti di geni.

Questa informazione genetica viene persa nell'analisi di raccolta di un'intera foglia che illustra la procedura. Accanto a me ci saranno Ellison As e Sanjeev Kuma, che forniscono supporto tecnico per questo lavoro nel nostro laboratorio. Per prima cosa, riempire una piastra di Petri rotonda da nove centimetri con 20 millilitri di soluzione A contenente enzimi protoplastici e inibitori della trascrizione e degli RNA.

Quindi raccogliere il materiale fogliare desiderato per campioni contenenti più di una singola foglia, come il campione mostrato qui. Disporre le foglie in pile di massimo 15 foglie. Successivamente, utilizzare una lametta per tagliare le foglie in strisce larghe un millimetro.

Trasferire immediatamente le strisce di foglia nella piastra di Petri utilizzando una pinzetta piatta, separare delicatamente le strisce e quindi infiltrare sotto vuoto i campioni due volte, per cinque minuti ciascuna. Successivamente, posizionare la piastra di Petri su un agitatore orbitale impostato a 90 RPM a temperatura ambiente e incubare i campioni per tre o quattro ore. Durante l'incubazione, utilizzare la pinzetta per separare le strisce di foglia l'una dall'altra a intervalli di mezz'ora.

Dopo la digestione, filtrare delicatamente la soluzione di protoplasti attraverso un filtro cellulare da 70 micron in un tubo da 50 millilitri. Per rimuovere le strisce di foglia, le strisce verranno trattenute. I protoplasti passeranno attraverso il filtro.

Ora utilizzare quattro millilitri di soluzione A per risciacquare delicatamente le strisce di foglia, raccogliendo il lavaggio nel tubo da 50 millilitri. Successivamente, trasferire la sospensione di protoplasti in provette con fondo rotondo e centrifugare i protoplasti per cinque minuti a 300 ×g e a temperatura ambiente. Avendo cura di non disturbare il pellet, aspirare delicatamente la maggior quantità possibile del sopranatante, quindi lavare i protoplasti con cinque millilitri di soluzione A nelle stesse condizioni di centrifugazione.

Infine, dopo aver rimosso il soprannatante, utilizzare una punta tagliata di P 1000 per risospendere i PROTOPLASTI in un volume appropriato di soluzione A per l'ordinamento immediatamente prima dell'ordinamento. Utilizzare una punta non tagliata di P 1000 per disgregare eventuali aggregati nella soluzione di protoplasti. Dissociare ulteriormente le cellule filtrando i protoplasti in una provetta di prelievo attraverso un filtro in fillon da 50 micron.

Quindi diluire la soluzione cellulare in modo appropriato per evitare l'occlusione del beccuccio di prelievo delle cellule. Dopo aver determinato le condizioni ottimali di prelievo cellulare, identificare i protoplasti positivi per GFP Proto utilizzando un laser Argonne a 488 nanometri, confrontando l'uscita del filtro passa-banda 580/30 con quella del filtro passa-banda 530/40. Si noti che i protoplasti positivi per GFP appariranno nella popolazione con valori elevati a 530 e bassi a 580.

Con i protoplasti non GFP nella popolazione a basso 530, basso 580, i protoplasti morti o in via di morte e i detriti compaiono nella popolazione ad alto 580; per la visualizzazione dei protoplasti ordinati mediante microscopia a fluorescenza, ordinare i protoplasti direttamente in almeno otto volumi di soluzione A dopo la concentrazione; i protoplasti possono essere ordinati in otto volumi di soluzione A e raccolti per la visualizzazione al microscopio a fluorescenza al fine di verificare l'arricchimento. Questa prima immagine mostra un esempio di arricchimento della linea cellulare TP 382, che esprime GFP nelle cellule di guardia. Esempi di rese ottenute con questo metodo, sia prima che dopo l'amplificazione, sono riassunti in questa tabella.

Le quantità ottenute comprese tra 500 picogrammi e 50 nanogrammi sono sufficienti per l'amplificazione mediante il sistema ovation PICO WTA e per l'analisi successiva tramite PCR quantitativa, sequenziamento di nuova generazione o microarray. Questa serie di immagini mostra diverse linee cellulari di protoplasti isolate e ordinate con il metodo appena descritto. Questi primi protoplasti sono stati ottenuti da KC 2 74, foglie di una sezione trasversale di un KC 2 74.

La foglia mostra che la GFP è espressa nel sistema vascolare. Questi protoplasti sono stati isolati da foglie KC 4 64 e una sezione trasversale di una foglia KC 4 64 mostra che l'espressione della GFP si trova nell'epidermide adassiale. Infine, questi protoplasti sono stati ottenuti da foglie TP 3 82 in foglie TP 3 82.

La GFP è espressa nelle cellule di guardia qui. Vengono mostrati tipici grafici a dispersione di acquisizione fax che illustrano l'output dei filtri a banda passante di 5 80 30 nanometri rispetto a quelli di 5 30 40 nanometri. Le porte di selezione mostrate sono quelle comunemente utilizzate durante l'ordinamento.

Questo primo diagramma a dispersione di protoplasti derivati da foglie di coal four di protoplasti protoplastificati in assenza di inibitori mostra una singola popolazione a bassa fluorescenza a 530 e bassa a 580. Mentre questo diagramma a dispersione di protoplasti derivati da foglie di tipo selvatico di coal four protoplastificati in presenza di inibitori dimostra lo spostamento della fluorescenza a 580 che si verifica a causa dello stress e della colorazione indotti dagli inibitori. Questi diagrammi a dispersione riguardano protoplasti derivati da foglie delle linee KC seven four, KC 4 64 e TP 3 82 rispettivamente.

Anche questi campioni sono stati trattati con il metodo pro in presenza di inibitori, dimostrando che la GFP è contenuta nelle popolazioni alta 530 e bassa 580. Per questo esperimento rappresentativo di PCR quantitativa, i campioni sono stati inizialmente ottenuti per ciascun tipo di frazione. I campioni sono stati quindi amplificati utilizzando il sistema ovation PICO WTA e la PCR quantitativa.

È stato eseguito l'uso di primer specifici per GFP. I valori mostrati sono i più alti in rosso e i più bassi in verde; le medie o i singoli valori, normalizzati rispetto al gene di riferimento actina due, sono indicati dalle barre orizzontali gialle. I risultati confermano nuovamente le valutazioni ottiche del contenuto cellulare di GFP nelle frazioni ordinate.

La popolazione alta 530 bassa 580 ha mostrato i livelli misurabili più elevati di espressione di GFP. Mentre la popolazione alta 530 alta 580 ha mostrato un'espressione di GFP circa 1000 volte inferiore, le popolazioni bassa 530 bassa 580 e bassa 530 alta 580 hanno mostrato livelli bassi di espressione di GFP paragonabili a quelli delle popolazioni di foglia intera controllo e di protoplasti non ordinati. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in quattro-cinque ore, dalla pianta alla popolazione cellulare ordinata, se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di monitorare costantemente il citofluorimetro e di ricalibrarlo se necessario, al fine di mantenere l'accuratezza del processo di ordinamento.

È stato trovato questo procedimento. Altri metodi, come l'analisi con micromatrici, possono essere eseguiti per confrontare i livelli di espressione genica in diversi tipi cellulari. Ora che questa tecnica è stata sviluppata, stiamo analizzando l'espressione genica in specifici tipi cellulari delle foglie in diverse fasi di sviluppo, e confronteremo questi dati con quelli ottenuti dalla foglia intera, generati nel progetto di agronomia.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare singoli tipi cellulari delle foglie utilizzando la sorta cellulare attivata da fluorescenza.