Imaging su cellule vive della permeabilizzazione della membrana lisosomiale durante la necroptosi

Questo protocollo descrive un metodo di imaging a cellule vive per monitorare la permeabolizzazione della membrana lisosomica durante la necroptosi utilizzando sonde fluorescenti che rilevano cambiamenti nell'integrità e acidificazione della membrana lisosomica. La sfida sul campo è caratterizzare la dinamica degli organelli danneggiati durante il processo di morte cellulare e definire con precisione come questo danno dovrebbe guidare o contribuire alla degenerazione cellulare. Per cominciare, impastare 5.000 cellule in due millilitri di materiale DMEM integrato con antibiotici in una ciotola sterile con fondo di vetro.

Metti la ciotola in un incubatore impostato a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% e incuba le cellule durante la notte. Aggiungi 20 microlitri di perline verdi di dextrano a 25 microgrammi per millilitro in un substrato DMEM fresco integrato con antibiotici per diluirlo. Rimuovi il substrato vecchio dalla ciotola e sostituiscilo con due millilitri di mezzo DMEM integrato contenente manzo.

Posizionare la teglia in un incubatore impostato a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% e incubare per 24 ore per permettere l'internalizzazione delle perle nei lisosomi. Ora aggiungi due microlitri di una soluzione LysoTracker a due millilitri di materiale DMEM fresco. Sostituisci il vecchio substrato con questa soluzione per le macchie.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per due ore. Attiva i componenti del sistema confocale accendendo il computer personale, il microscopio, la potenza dello scanner, la potenza laser, l'emissione laser e l'alimentazione Leica. Attiva i controlli ambientali, incluso il regolatore di temperatura, chiamato Cube, e il controller del miscelatore di gas anidride carbonica, chiamato Brick.

Apri l'apporto di anidride carbonica e ossigeno. Imposta il controller di temperatura a 37 gradi Celsius. Imposta il controller di gas e umidità al 5% di anidride carbonica e 95% di umidità.

Assemblare la camera di imaging. Dopo la colorazione, lava le cellule tre volte con due millilitri di PBS, poi aggiungi due millilitri di mezzo DMEM fresco integrato. Applica olio a immersione sull'obiettivo prima dell'immagini.

Monta il piatto sul palco del microscopio. Regolare l'intensità del laser fino al 3% ma non oltre il 5%Poi regolare il guadagno del rilevatore nel software del microscopio per ottimizzare il segnale. Minimizza lo sfondo regolando la barra di contrasto.

Acquisire immagini di base delle cellule non trattate, che fungono da condizione di controllo. Riportare la piastra nella cappa a flusso laminare e aggiungere un millilitro di DMEM antibiotico integrato con induttori della morte cellulare. Nel software di acquisizione, imposta la modalità su XYT, formatta su 512 per 512, velocità su 400, zoom a tre, media linea a uno, accumulo linea a tre, accumulo fotogrammi a uno, intervallo di tempo a tre minuti, durata a otto ore e abilita l'automessa a fuoco.

Clicca su start per iniziare l'acquisizione in time-lapse. Le prime immagini hanno confermato la presenza di punti stabili di LysoTracker e di dextran marcato con fluoresceina, indicando lisosomi intatti prima del trattamento. Quattro ore dopo il trattamento con TSZ, la fluorescenza di LyoTracker era visibilmente ridotta, mentre il destrono iniziava a mostrare una distribuzione citosolica diffusa, indicando la permeabilizzazione iniziale della membrana lisosomica.

Otto ore dopo il trattamento, il segnale di LysoTracker era quasi completamente scomparso, mentre molte cellule mantenevano punti di dextrano verde con un segnale citosolico verde diffuso. Dimostriamo che la permeabolizzazione della membrana lisosomica può essere visualizzata direttamente in una cellula viva in fase di induzione necroptotica. Questo protocollo dimostra che la combinazione di LysoTracker e perle di dextrano consente il monitoraggio simultaneo del pH lisosomale e del rilascio del carico in tempo reale.

Un elemento importante per il progresso di questo protocollo di immagine a cellule vive è la sua capacità di monitorare in tempo reale un piccolo cambiamento di pH e la permeabilizzazione della membrana lisosomica, catturando eventi dinamici che vengono trascurati dall'analisi degli endpoint come la citometria a flusso e la colorazione monostrato.