Gene Transfer per l'orecchio del mouse Sviluppo Inner

Jane si è trasferita all'orecchio interno del topo in via di sviluppo mediante elettroporazione in vivo di Ling Wang, Han Jang e John Burgandy, Centro di Ricerca sull'Udito dell'Oregon, Università delle Scienze della Salute dell'Oregon. Ok. Mi chiamo John Burgandy. Il mio laboratorio si trova presso il Centro di Ricerca sull'Udito dell'Oregon dell'Università delle Scienze della Salute dell'Oregon.

Mi chiamo Ang. Sono un ricercatore nel laboratorio di John. Sono anche Ang nel laboratorio di John come assistente di ricerca.

La nostra presentazione è suddivisa in quattro parti. La prima è la laparotomia ventrale. Illustreremo l'anestesia a base di pentobarbital sodico, come verificare l'adeguatezza dell'anestesia, la protezione della cornea, la preparazione del sito chirurgico, la disinfezione, il modulo dati per interventi chirurgici di sopravvivenza nei topi, l'incisione mediana ventrale nell'ambiente chirurgico attraverso la cute e la parete addominale ed esternazione dei corni uterini.

La seconda parte riguarda la microiniezione transuterina. Illustreremo la transilluminazione dell'embrione, il riorientamento dell'embrione, la fabbricazione della pipetta, la microiniezione e l'iniezione microiniettiva nell'Otis al giorno embrionale 11,5 e al giorno embrionale 12,5. La terza parte riguarda l'elettroporazione in vivo.

Mostriamo il posizionamento degli elettrodi in stile pagaia e l'elettroporazione dell'orecchio interno del topo al giorno embrionale 11,5. La parte quattro illustra i risultati rappresentativi. Mostriamo l'espressione di GFP in coclee embrionali tardive e postnatali precoci.

Che è risultato dall'elettroporazione in vivo dell'Otis con un plasmide di espressione al giorno embrionale 11,5, parte prima della laparotomia ventrale. La femmina gravida viene tenuta saldamente afferrando la pelle dietro il collo, la coda e l'arto posteriore sinistro. Viene somministrata un'iniezione intraperitoneale di anestetico a base di pentobarbital sodico dopo aver passato l'addome con etanolo al 70%.

Il topo viene posizionato all'interno della sua gabbia di casa per quattro o cinque minuti per permettere all'anestetico di fare effetto. Vengono eseguiti test di pizzicamento della zampa e della coda per valutare l'adeguatezza dell'anestesia. Questa femmina reagisce al pizzicamento della coda e necessita di altri due minuti prima di diventare insensibile agli stimoli nocivi.

Viene applicato un unguento oftalmico sterile sugli occhi per proteggere la cornea dalla desiccazione. Prepariamo il sito chirurgico all'interno di una cappa chimica per minimizzare la dispersione di peli e forfora. I peli vengono rasati con una lama fine per esporre la cute che ricopre la parete addominale.

La rimozione completa del pelo favorisce la guarigione dell'incisione nell'ambito postoperatorio. La disinfezione della cute addominale si ottiene alternando passate di etanolo al 70%, Betadine e nuovamente etanolo al 70%. Spazzolare sempre dalla parte rostrale a quella caudale e utilizzare ogni volta un batuffolo di cotone chirurgico o un applicatore con estremità di cotone nuovo.

Per ogni passaggio, valutiamo la profondità e la qualità delle respirazioni durante la disinfezione per assicurarci che l'animale sia inoffensivo. Immediatamente dopo il secondo passaggio con etanolo al 70%, posizioniamo la superficie ventrale della topolina rivolta verso il basso su un telo sterile e la collochiamo su un tappetino riscaldato per due o tre minuti al fine di riscaldarla. Questo è un momento opportuno per registrare i dati preoperatori sul modulo di registrazione per interventi chirurgici sopravvivenza nei topi. Abbiamo allegato il nostro modulo di raccolta dati per interventi chirurgici sopravvivenza nei topi come informazione supplementare.

Si consiglia di includere il foglio dati e il protocollo di cura degli animali in modo che il comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali possa verificare come si intende monitorare i dati preoperatori, operatori e postoperatori. Compiliamo un modulo di registrazione per ogni soggetto sottoposto a intervento chirurgico. Preferiamo eseguire gli interventi in un ambiente sterile, anche se ciò di solito non è richiesto per i roditori.

La superficie di lavoro è separata dal motore del ventilatore e dal contenitore del plenum, pertanto nessuna vibrazione viene trasmessa all'utente. Durante la microiniezione, abbiamo allegato come informazione supplementare uno schema delle modifiche apportate alla nostra cappa a flusso laminare per facilitare il trasferimento genico in utero; le modifiche essenziali comprendono tagli per l'illuminazione a binario a bassa altezza e prese nascoste per i cavi di alimentazione degli strumenti, nonché un percorso per il cablaggio dei circuiti elettrici ausiliari. L'unità chirurgica comprende la sacca endovenosa di soluzione fisiologica con lattato, il bagno caldo, il manipolatore X, Y, Z, il microscopio stereoscopico a fluorescenza, la fonte luminosa a fibra ottica e gli strumenti chirurgici.

I pedali a pressione sono utilizzati per attivare il microiniettore e per entrare in fuoco con l'elettrodo. Gli strumenti chirurgici per il microscopio vengono sterilizzati in un autoclave. Gli strumenti devono essere sterilizzati nuovamente tra un topo e l'altro utilizzando un sterilizzatore a perle di vetro oppure rieseguendo l'autoclavaggio del portaaighi.

Le pinze ad anelli a forbice e le pinze vascolari sono gli strumenti essenziali. Effettuare un'incisione mediana ventrale, afferrare la cute con le pinze vascolari ed escindere l'integumento con le forbici a punta sferica, estendendo l'incisione da 10 a 14 millimetri. Individuare la banda bianca avascolare di tessuto connesso chiamata linea alba e praticare un'incisione lungo la linea alba addominale mediana con le forbici a punta sferica.

Avendo cura di non danneggiare l'intestino o le borse adipose inguinali. Irrigare immediatamente l'addome con soluzione sterile di Ringer lattato preriscaldata. Valutare i siti di incisione nella cute e nella parete addominale per verificare la presenza di sanguinamento.

Applicare pressione diretta con pinze atraumatiche per arrestare eventuali lievi sanguinamenti, quindi esternare i due corni uterini con pinze a punta ad anello. Afferrare delicatamente il corno uterino destro con un’estremità anellata della pinza ed estrarre l’utero verso l’incisione mediana. Utilizzare la mano libera per manipolare delicatamente il lato laterale della femmina al fine di facilitare l’aggancio dell’utero.

Le pinze non vengono mai utilizzate per comprimere l'utero ed estrarlo. Poiché ciò potrebbe danneggiare la vascolarizzazione uterina o gli embrioni, ripetere la procedura di esternalizzazione per l'utero sinistro. Irrigare immediatamente le corna uterine appena esternalizzate con soluzione di Ringer lattato pre-riscaldata e reinserire delicatamente i pad adiposi o gli intestini qualora si esternalizzassero insieme all'utero.

Questo non si verifica spesso. Seconda parte: microiniezione uterina. La femmina gravida viene posizionata al di sotto dell'obiettivo con lunga distanza di lavoro e una luce a fibra ottica con cavo flessibile viene appoggiata alla parete uterina.

L'utero viene delicatamente premuto con un dito della mano libera. Per facilitare l'identificazione dell'orientamento dell'embrione. La luce del cavo in fibra ottica deve essere impostata all'intensità minima necessaria per valutare con precisione l'orientamento dell'embrione.

La luce intensa può trasmettere calore all'utero, il che potrebbe causare complicazioni. Teniamo il fascio luminoso in fibra ottica e l'utero in una mano e utilizziamo un dito dell'altra mano libera per riposizionare l'embrione mediante palpazione delicata. Mostriamo nei seguenti tre video al microscopio clip EC e le comuni orientazioni dell'embrione osservate all'interno dell'utero.

Lo spettatore vedrà la vista microscopica che osserviamo durante la trasilluminazione, anche se in bianco e nero; la trasilluminazione dell'utero permette la rilevazione dell'orientamento dell'embrione in vivo. In questo esempio, l'embrione si trova in posizione di testa in giù, con la superficie ventrale rivolta verso l'osservatore. Alternando avanti e indietro l'utero, possiamo identificare gli arti posteriori destro e sinistro, la coda e l'occhio sinistro del cefalone.

In questo esempio, l'embrione si trova nuovamente in posizione verticale sulla testa, ma ruotato di circa 90 gradi rispetto all'asse anteriore-posteriore. Oscillando delicatamente l'utero avanti e indietro, possiamo osservare le forme a pagaia che definiscono l'arto posteriore sinistro e l'arto anteriore sinistro. Anche il romboencefalo è ben visibile.

L'embrione è in posizione eretta con il lato sinistro rivolto verso l'osservatore. Il nascente quarto ventricolo è riconoscibile come una zona luminosa nel rombencefalo. Sono inoltre evidenti il cefalone dell'occhio sinistro, l'arto anteriore sinistro e gli arti posteriori sinistri.

Una leggera pressione sull'utero riorienta leggermente gli embrioni, permettendo di individuare il tronco principale della vena cefalica primaria e i suoi rami anteriore e posteriore, indicati rispettivamente con asterisco bianco e nero. Come vedremo, l'Otis si trova a metà strada tra il ramo anteriore e quello posteriore della vena cefalica primaria. L'Otis stesso non può essere visto attraverso l'utero mediante trasilluminazione.

Mostriamo in due successivi filmati al microscopio come riorientare l'embrione per la microiniezione nell'Otis assist. L'obiettivo è identificare i punti di riferimento embrionali che permettono l'individuazione della posizione dell'otis nella regione laterale della testa. Mesen con, il nostro obiettivo è riorientare l'embrione da una posizione dorsale a una laterale, in modo da poter identificare la vena principale della testa.

Il mesencefalo, la quarta ventricolo e l'arto sinistro sono evidenti nella posizione dorsale. Una leggera pressione sull'utero modifica l'orientamento dell'embrione da dorsale a laterale. L'occhio sinistro, il cefalon, il mesencefalo e la quarta ventricolo sono chiaramente visibili.

La vena principale della testa e il suo ramo posteriore, indicati dall'asterisco, sono anch'essi evidenti. Il ramo anteriore della vena principale della testa non è chiaramente rilevabile. Il nostro obiettivo, ancora una volta, è orientare l'embrione in modo da poter identificare la vena principale della testa, ma con un ingrandimento maggiore, appropriato per la microiniezione uterina.

Le arterie uterine, la banda deciduale e l'occhio sinistro sono visibili in questa prospettiva laterale. Una leggera pressione sull'utero sposta la posizione dell'embrione, permettendo di individuare il quarto ventricolo e l'occhio sinistro. La vena cefalica primaria e il suo ramo posteriore, indicati dall'asterisco, conferiscono alla vena cefalica primaria e ai suoi rami una forma simile ai pali di un'area di calcio americano.

La vescica otica non può essere vista attraverso l'utero, ma si trova al centro dei montanti. Lynn ha avviato una sequenza di iniezione per un embrione. Ella trasillumina l'utero, riorienta l'embrione per una microiniezione e porta nella zona visiva la pipetta per microiniezione riempita di verde brillante.

La pipetta di microiniezione è collegata a un porta-pipetta che viene tenuto da un micromanipolatore X, Y, Z. Il supporto magnetico del micromanipolatore è fissato a una piastra d'acciaio con base in teflon che permette un posizionamento generale agevole della pipetta di microiniezione. L'ago viene avanzato utilizzando la manopola di regolazione micrometrica anteriore sul micromanipolatore in modo appropriato.

Le pipette fabbricate sono essenziali per effettuare microiniezioni traumatiche nell'embrione di topo allo stadio precoce di Otis. Tiriamo una capillare in vetro borosilicato a parete spessa mediante un estrattore orizzontale per pipette. La pipetta risultante mostrata in A viene rotta manualmente con pinzette nella posizione con diametro esterno compreso tra circa 14 e 16 micron, indicata dalla freccia in B. La rottura irregolare della pipetta mostrata in C è dentellata e fragile.

Smussiamo la pipetta a circa 20 gradi per affilare la punta, come mostrato nei parametri del pannello D per il tiraggio e lo smussamento delle pipette per microiniezione. Nei prossimi due filmati ottenuti mediante microscopia, mostriamo la microiniezione nell'otocisto murino ai giorni embrionali 11,5 e 12,5. Il nostro obiettivo è dimostrare la microiniezione uterina nell'otocisto murino al giorno embrionale 11,5.

Prima, iniettiamo gli oti senza la presenza dell'utero per mostrare in modo inequivocabile l'aspetto di un'iniezione correttamente mirata. Successivamente, dimostriamo un'autentica microiniezione transuterina. Per questa prima iniezione, l'utero è stato inciso in modo completo per permettere l'estroflessione della sacca viscerale; la banda deciduale sovrastante il sacco vitellino viscerale è stata rimossa.

La placenta rimane attaccata all'utero e l'embrione è vivo. Rimuovendo in modo focale l'utero, si osserva il quarto ventricolo, la vena principale della testa e i suoi rami anteriore e posteriore, la pipetta e la posizione approssimativa della cisti in bianco. All'inizio di questa sequenza di iniezione, si rileva il flusso sanguigno nella vascolarizzazione del sacco vitellino viscerale.

La pipetta viene avanzata attraverso il sacco vitellino viscerale e il dai viene iniettato nell'osis note, nel dotto linfatico endolinfatico in posizione dorsale e nella posizione delle orecchie interne al centro dei montanti verticali. Le orecchie interne si trovano a metà strada tra le ramificazioni anteriore e posteriore della vena cefalica primaria; l'iniezione microuterina nel giorno embrionale 11,5 del topo richiede l'individuazione della vena cefalica primaria e di almeno una delle sue ramificazioni per stimare la posizione dell'otic assist.

Nel nostro esempio schematico, vengono rilevati sia il ramo anteriore che quello posteriore della vena cefalica primaria, con il territorio OUC indicato in bianco. Una rappresentazione più realistica dell'embrione è quella in cui viene rilevato il tronco principale della vena cefalica primaria insieme a un solo suo ramo; nell'esempio mostrato, si osserva soltanto il ramo posteriore della vena cefalica primaria, ma ciò è sufficiente per interpretare la posizione delle vescicole otiche. Il catetere PT viene avanzato attraverso l'utero e il colorante viene iniettato nelle vescicole otiche.

Attendiamo 30 secondi per permettere al colorante di essere eliminato dalla cavità amniotica, momento in cui possiamo osservare dorsalmente il dotto endolinfatico e il vestibolo. Concludiamo con una vista a basso ingrandimento dell'embrione il cui cisto abbiamo appena iniettato, al fine di fornire una prospettiva anatomica; in questa vista, si osservano il quarto ventricolo, l'occhio sinistro e la vascolarizzazione uterina. Dimostriamo la tecnica di trans e microiniezione nel cisto otico del topo al giorno embrionale 12 e la microiniezione nel nascente quarto ventricolo del romboencefalo.

La transilluminazione ci permette di individuare la vena principale della testa in questa vista laterale sinistra, così come l'occhio. La pipetta viene avanzata attraverso l'utero fino alla vescicola otica e viene iniettato il colorante per riempirne la cavità. Per iniettare il quarto ventricolo, ruotiamo l'embrione di 90 gradi per ottenere una vista dorsale del rombencefalo.

La cisti iniettata a sinistra si trova ora sul lato sinistro. La pipetta viene avanzata attraverso l'utero e il fast green viene miscelato con il lor. Il dextrano coniugato viene iniettato nel quarto ventricolo.

Si noti che il volume di colorante iniettato non penetra nel mesencefalo in vivo. La fluorescenza viene valutata dopo l'iniezione per verificare la localizzazione del dextrano nel quarto ventricolo. L'embrione viene quindi riorientato dalla posizione dorsale a quella laterale.

Il dotto linfatico endo si trova appena ventrale al quarto ventricolo in questa vista laterale. La fluorescenza in vivo conferma la localizzazione del dextrano nel quarto ventricolo. Alla nascita, esaminiamo i cuccioli per rilevare la fluorescenza verde nel quarto ventricolo mediante una fluorescenza episcopica.

Con il microscopio stereoscopico, i cuccioli con fluorescenza verde nel cervello posteriore presentano un orecchio interno che è stato manipolato durante l'embriogenesi, parte tre, elettroporazione in vivo. Dopo aver riempito la cisti con il plasmide di espressione, l'utero viene irrigato frescamente con soluzione di Ringer lattato preriscaldata. La transilluminazione facilita il posizionamento al centro della cisti ODU nel campo elettrico.

La punta metallica della luce a fibra ottica viene ritratta dalla superficie uterina. Prima di avviare la serie di impulsi a onda quadra, nel prossimo frammento video di microscopia mostriamo un ciclo completo di elettroporazione in vivo. L'elettroporazione della vescicola otica di topo al giorno embrionale 11,5 richiede un posizionamento delicato degli elettrodi a paletta sull'utero.

In questo esempio, la cisti otica sinistra è stata riempita con un plasmide di espressione e l'utero è stato recentemente irrigato con soluzione di Ringer lattato. Il catodo è posizionato lateralmente rispetto alla cisti otica riempita e l'anodo è posizionato medialmente all'inizio della sequenza di elettroporazione; la cisti otica è centrata nel campo dell'elettrodo a paletta. L'utero viene delicatamente compresso e la serie di impulsi a onda quadra viene avviata mediante un interruttore a pedale.

Idealmente, ogni impulso eroga da 60 a cento milliampere di corrente. L'utero viene quindi rilasciato e immediatamente irrigato. L'utero appena irrigato viene reinserito nella cavità addominale mediante una leggera pressione esercitata con la pinza ad anello.

Una volta che l'utero è stato internalizzato, la cavità addominale viene lavata con circa quattro mil di soluzione fisiologica con lattato, lasciando circa un mil di soluzione fisiologica con lattato nella cavità addominale per aiutare a mantenere l'idratazione della madre, che berrà meno acqua del solito immediatamente dopo un intervento chirurgico addominale. La parete addominale e successivamente la cute vengono chiuse con punti di sutura riassorbibili utilizzando un maniscalco per aghi. Il nostro maniscalco per aghi è dotato di una forbice integrata che semplifica la chiusura.

Preferiamo un punto a correre sia per la parete addominale che per la cute. Fissiamo ogni due punti per fornire un supporto aggiuntivo nel sito dell'incisione. Somministriamo un farmaco antinfiammatorio non steroideo per via sottocutanea prima di posizionare l'animale nella gabbia di recupero.

Consultare il personale veterinario per stabilire quali analgesici profilattici siano preferiti dal comitato istituzionale per la cura e l'utilizzo degli animali. La femmina viene adagiata in un campo operatorio sterile e posizionata sul fondo della gabbia riscaldata per il recupero. La gabbia di recupero contiene materiale per il nido, un tubo rosso per riparo, mangime per animali da laboratorio e una bottiglia d'acqua.

La gabbia viene riassemblata con un cappuccio filtrante in alto la mattina dopo l'intervento chirurgico. La femmina è ben curata, deambula liberamente ed è in grado di sollevarsi sulle zampe posteriori per osservare la parte superiore aperta della gabbia. La linea di sutura sull'addome è pulita, asciutta e non mostra segni di deiscenza, arrossamento o gonfiore.

Abbiamo allegato un documento che tratta lo sviluppo di protocolli per la cura degli animali applicabili al trasferimento genico in utero. Il documento contiene termini che potrebbero risultare utili durante la progettazione di un protocollo specifico per la vostra istituzione, in consultazione con il comitato per la cura e l'uso degli animali. Parte quattro, risultati rappresentativi.

Pannelli A e B mostrano un risultato rappresentativo di un'orecchio interno prelevato da un cucciolo di sei giorni postnatale, il cui Otis è stato iniettato con un plasmide di espressione della proteina verde fluorescente potenziata al giorno embrionale 11,5 e successivamente elettroporato. La parete laterale del cocleo è stata rimossa dalla regione mediale e apicale. L'espressione di GFP è presente soltanto dalla base fino alla regione mediale del cocleo e segue la distribuzione del marcatore delle cellule ciliate miosina sette A mostrato nel pannello B. Il pannello C mostra una proiezione confocale a basso ingrandimento del giorno embrionale.

18,5 organo della corti di topo immuno marcato con un anticorpo contro la miosina sette A; le cellule trasfettate sono distribuite in tutto l'organo della corti. Il pannello D mostra una proiezione confocale ad alta ingrandimento del giorno embrionale. 18,5 organo della corti di topo colorato con cin.Seven.

Viene rilevata un'espressione di GFP nelle cellule ciliate interne ed esterne, nelle cellule interfalangee, nelle cellule pilastri e nelle cellule TER. Il trasferimento genico mediato da elettroporazione all'Otide al giorno embrionale 11,5 trasfecta i progenitori che danno origine a tutti i tipi cellulari componenti l'organo del Corti.