Quantificare le attività di Cis-Regolamentazione Elementi nella retina di topo Elettroporazione Espianto

L'obiettivo generale di questa procedura è elettroporare impianti retinici di topo con reporter fluorescenti trascrizionali e quantificare i loro livelli di espressione. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto il tessuto retinico di topo neonatale mediante dissezione. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'elettroporare la retina con costrutti di DNA reporter fluorescenti.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel coltivare le retine elettroporate come innesti per otto giorni. L'ultimo passaggio della procedura prevede il recupero dell'espianto retinico e la quantificazione dei livelli di espressione dei reporter fluorescenti. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano i livelli relativi di espressione di diversi costrutti reporter con promotori nella retina in via di sviluppo del topo mediante elettroporazione di x espianti retinici, seguita da un'analisi quantitativa dei dati.

Il mio nome è Joe Corbo e sono un membro del corpo docente del Dipartimento di Patologia e Immunologia presso la Washington University School of Medicine di St. Louis. Oggi presenteremo un protocollo video che illustra la tecnica di elettroporazione X explan nelle retine di topi neonati, al fine di quantificare l'attività di elementi regolatori cis specifici dei fotoricettori, e a dimostrare questo protocollo sarà una studentessa laureata del mio laboratorio, Cindy Montana. Prima sterilizzare la camera di elettroporazione e tutti gli strumenti con etanolo al 70% in preparazione del prelievo oculare.

Disinfettare entrambi i guanti e il piano di lavoro con etanolo e mantenere condizioni sterili per tutta la durata della procedura. Successivamente, in una cappa a flusso laminare, pipettare sei millilitri di mezzo di dissezione in una piastra di Petri sterile da 60 millimetri e tre millilitri di mezzo in due piastre sterili da 35 millimetri. Nuovamente al banco di lavoro, disinfettare la testa e il collo di un topo neonato con etanolo al 70%.

Dopo aver decapitato rapidamente la testa utilizzando forbici, trasferire la testa in una piastra sterile da 100 millimetri, rimuovere il cuoio capelluto con piccole forbici per esporre gli occhi sotto un microscopio stereoscopico. Utilizzando pinze curve, estrarre delicatamente l'occhio dall'orbita e quindi posizionarlo in una piastra da 35 millimetri contenente il mezzo di dissezione. Continuare a raccogliere occhi in modo da ottenere da tre a quattro occhi per ogni aliquota di DNA da elettroporare, mantenendo occhi e mezzo di dissezione a temperatura ambiente fino al completamento.

Disinfettare sia una lametta da rasoio che l'involucro di una pipetta di trasferimento in plastica sterile con etanolo al 70%, quindi utilizzare la lametta per tagliare la punta della pipetta abbastanza in alto da poter pipettare un intero occhio. Utilizzando la pipetta allargata, trasferire un occhio dalla piastra da 35 millimetri alla piastra da 60 millimetri sotto un microscopio stereoscopico ad alta potenza. Usare pinzette fini per rimuovere eventuali tessuti, come i muscoli estrinseci e il tessuto adiposo, dalla superficie dell'occhio.

Quindi rimuovere il nervo ottico staccandolo alla base. Per isolare la retina, praticare un piccolo foro nella sclera al livello del limbus; la sclera e l'epitelio pigmentato retinico appaiono lucidi rispetto al tessuto retinico, che è grigio opaco. Inserire una punta di ciascuna coppia di pinze nel foro e strappare delicatamente la sclera e l'epitelio pigmentato retinico (RPE).

Assicurarsi di lasciare la lente al suo posto. Utilizzare la pipetta allargata per trasferire la retina dissezionata nella seconda piastra da 35 millimetri contenente mezzo di coltura. Raccogliere tutte le retine e conservarle in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius.

Finché non si esegue l'elettroporazione all'interno di una cappa per colture cellulari per ogni DNA Eloqua da elettroporare, riempire una piastra sterile da 35 millimetri con mezzo di dissezione e una seconda piastra con mezzo di coltura. Utilizzando una pipetta P200, lavare le camere della piastra per elettroporazione con 1x PBS sterile per 3 volte. Riempire le camere con aliquote di DNA da 60 microlitri e riempire tutte le camere non utilizzate con 60 microlitri di 1x PBS.

Collegare gli elettrodi alla capsula di elettroporazione e impostare le condizioni appropriate sull'elettroporatore. Utilizzare pinzette fini per afferrare le retine attraverso il cristallino e trasferirle nelle camere di elettroporazione. Posizionare fino a quattro retine in ogni camera.

Disporre le retine in modo che la lente appoggi sulla barra metallica collegata all'elettrodo positivo. Pulire le pinzette tra una camera e l'altra per evitare il trasferimento di DNA da una camera all'altra. Una volta allineate tutte le retine, premere il pulsante di avvio sull'elettroporatore.

Dovrebbero formarsi piccole bolle sulla barra metallica collegata all'elettrodo negativo. Scollegare gli elettrodi e spegnere l'elettro utilizzando pinzette. Spostare delicatamente le retine lontano dalle pareti della camera.

Trasferire le retine dalle camere alle piastre da 35 millimetri contenenti il mezzo di dissezione. Utilizzando una pipetta sterile, trasferire le retine dal mezzo di dissezione alle piastre da 35 millimetri contenenti il mezzo di coltura. Etichettare le pozzette di una piastra di coltura sterile a sei pozzette e riempire ciascuna pozzetta con tre millilitri di mezzo di coltura.

Utilizzare pinze sterili per posizionare delicatamente filtri circolari Watman Nucleo sulla superficie del mezzo in ogni pozzetto, con il lato lucido dei filtri rivolto verso l'alto. Con l'aiuto di un microscopio stereoscopico, trasferire una singola retina sul filtro utilizzando una pipetta sterile, con il lato della lente rivolto verso il basso. Se la retina si posiziona con il lato della lente rivolto verso l'alto, aspirarla nuovamente nella pipetta e riprovare.

Posizionare non più di quattro retine in ciascun pozzetto, mantenendole in gocce separate. Una volta posizionate le retine nei pozzetti, trasferire la piastra di coltura in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e coltivare per il tempo desiderato. Di solito, dopo otto giorni, qui si osservano risultati soddisfacenti di elettroporazione, con espressione del costrutto di DNA su un quarto fino a un terzo della superficie retinica.

I livelli di fluorescenza vengono quantificati confrontando regioni uniformemente elettroporate che esprimono il costrutto CRE con regioni al di fuori della retina, quindi normalizzati rispetto all'espressione di controllo di GFP. I fotorecettori a bastoncello in particolare vengono trasdotti in modo efficiente, come mostrato. Di seguito sono riportati i risultati di un'elettroporazione in cui due promotori specifici per i bastoncelli guidano l'espressione di GFP e DS red nello strato nucleare esterno.

Sovrapponendo i due profili di espressione alla colorazione con DPI mostrata qui in blu, risulta evidente l'espressione specifica dei fotorecettori. Non si osserva alcuna espressione né nel livello interclear né nel livello delle cellule gangliari. Dopo aver visto questo video, dovreste avere un'idea chiara di come si esegue la dissezione, l'elettrofisiologia e la coltura di espianti retinici murini al fine di quantificare l'attività degli elementi regolatori dei cisti retinici.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.