Valutare i cambiamenti teratogeni in un modello di Zebrafish di esposizione alcolica fetale

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare gli effetti dell'esposizione all'etanolo sullo sviluppo del pesce zebra. Questo viene ottenuto esponendo innanzitutto il pesce zebra a dosi di etanolo in acqua normale per embrioni durante le prime fasi dello sviluppo. Successivamente, l'etanolo viene rimosso e i pesci vengono lasciati sviluppare fino al tempo desiderato.

Successivamente, sia i cambiamenti fisici macroscopici sia le alterazioni nell'espressione genica vengono analizzati negli embrioni trattati rispetto a quelli di controllo. Infine, gli embrioni vengono manipolati mediante mRNA, morpholini o farmaci per determinare se i difetti dello sviluppo indotti dall'etanolo possano essere modificati. In definitiva, una combinazione di PCR quantitativa e ibridazione in situ mostra che gli effetti dell'etanolo sugli embrioni di pesce zebra in via di sviluppo sono associati a modifiche nell'espressione genica.

Una successiva manipolazione dei livelli di espressione genica potrebbe migliorare o prevenire i difetti dello sviluppo indotti dall'etanolo. Le tecniche che stiamo dimostrando oggi ampliano la nostra conoscenza sulla natura della sindrome feto-alcolica, oltre a conservare i processi dello sviluppo nei vertebrati. A dimostrare oggi sarà Steph Erhardt, un tecnico del mio laboratorio, per il trattamento degli embrioni con etanolo.

Allevare gli embrioni derivanti da incroci di tipo selvatico fino alla fase a cupola a 28 gradi Celsius in acqua per embrioni. Suddividere gli embrioni di una covata nel numero desiderato di piastre, con un numero compreso tra 10 e 50 embrioni per piastra. Aggiungere agli embrioni una soluzione di etanolo al 0,2-2,5% volume su volume in acqua per pesci e rimettere in incubatrice per un periodo massimo di 24 ore dopo la durata desiderata di esposizione.

Sostituire l'etanolo contenente acqua con acqua per embrioni fresca per un periodo specifico di sviluppo al fine di raccogliere mRNA per la PCR quantitativa. Posizionare gli embrioni appaiati in provette einor. Rimuovere l'acqua dei pesci e aggiungere buffer di lisi con TCEP.

Utilizzando un trituratore motorizzato, dissociare fisicamente gli embrioni, quindi posizionarli nella centrifuga per una centrifugazione lenta. Trasferire il soluto in una colonna di pre-pulizia, quindi centrifugare la colonna per rimuovere i frammenti grandi dissociati.

Utilizzare un kit di isolamento dell'RNA per estrarre l'RNA. Successivamente sintetizzare il CDNA utilizzando metodi standard per l'analisi con QPCR o microarray per preparare gli embrioni per l'ibridazione in C e la colorazione con anticorpi. Fissare gli embrioni da sei a 24 ore dopo la fecondazione in paraformaldeide al 4% per tutta la notte a quattro gradi Celsius, dopo tre lavaggi in PBS contenente 0,1% di tween.

Rimuovere la coriona utilizzando due pinzette affilate al microscopio. Successivamente, trasferire gli embrioni nel metanolo mediante una serie di cambi del liquido con concentrazione crescente di metanolo e concentrazione decrescente di PBT. Dopo aver trasferito gli embrioni nel metanolo al 100%, conservarli a meno 20 gradi Celsius per la colorazione della cartilagine.

Allevare gli embrioni fino a cinque o sei giorni dopo la fecondazione. Fissarli durante la notte in paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius. Successivamente, lavarli tre volte in PBT per determinare quali livelli di espressione genica sono cambiati a seguito dell'esposizione all'etanolo.

Eseguire la QPCR progettando innanzitutto dei primer per convalidare i primer. Testarli su tre campioni biologici. Questi campioni biologici di controllo possono essere di qualsiasi età, purché il gene di interesse sia espresso in quella particolare età.

Dopo aver verificato i primer, utilizzare il cDNA precedentemente preparato per eseguire la QPCR, eseguendo i campioni in triplicato e includendo un campione di controllo per un controllo del pesce zebra; utilizziamo i primer per gap dh. Normalizzare i risultati rispetto ai livelli di gap DH. Quindi calcolare il livello relativo di espressione genica utilizzando il metodo delle potenze.

Variazione del metodo delta delta CT che mostra la differenza sperimentale rispetto al tipo selvatico. Per costrutto di ibridazione in C. Sondi ribo marcati diretti verso il gene di interesse.

Quindi, incubarli con embrioni di pari età utilizzando condizioni standard e rilevare il profilo di ibridazione mediante fosfatasi alcalina; acquisire le immagini dei campioni utilizzando un microscopio stereoscopico per valutare lo sviluppo morfogenetico, ad esempio potrebbe essere utile acquisire immagini di embrioni vivi per valutare la distanza interoculare e la lunghezza del corpo. In primo luogo, fissare gli embrioni in paraformaldeide. Successivamente, acquisire immagini per esaminare gli effetti del trattamento con alcol sulle strutture cartilaginee in via di sviluppo nella larva colorata.

Fissare i pesci zebra utilizzando lc e luce blu per diverse ore, fino a tutta la notte, per trattenere e schiarire gli embrioni prima dell'acquisizione delle immagini. Analizzare la morte cellulare in embrioni vivi incubandoli in cinque milligrammi per millilitro di orange aine in PBS per un'ora. Lavare gli embrioni tre volte in PBS, quindi montarli su vetrini, acquisire le immagini dei campioni utilizzando un microscopio confocale e utilizzare serie Z per creare immagini composite.

Dopo aver identificato i geni la cui espressione è diminuita a seguito dell'esposizione all'etanolo, iniettare da 25 a 200 picogrammi per nanolitro di mRNA capppato per un gene di interesse in embrioni allo stadio di una-due cellule. Lasciare che le uova si riprendano in un incubatore riscaldato a 28 gradi Celsius fino a quando non raggiungono lo stadio a cupola, quindi trattarle con etanolo come in precedenza. Per i geni la cui espressione aumenta come risultato dell'esposizione all'etanolo, ridurne l'espressione iniettando quantità comprese tra picogrammi e nanogrammi di morpholino antisenso in embrioni allo stadio di una-due cellule.

Questo protocollo è simile a quello utilizzato per l'mRNA cappato. Se si inietta un mRNA, un morfolino per lo splicing, misurare l'efficienza mediante RT-PCR per confrontare le quantità di trascritti splicati e non splicati, al fine di analizzare l'attività genica dipendente dalla dose; titolare il morfolino iniettato e lasciare sviluppare gli embrioni fino alla fase desiderata prima di trattarli con etanolo. L'esposizione degli embrioni di pesce zebra all'etanolo provoca una serie di difetti genetici e dello sviluppo correlati ai fenotipi riscontrati in altri vertebrati.

Uno sviluppo anomalo dei tessuti assiali, compreso il notocorda, porta a un accorciamento e talvolta a un'interruzione della notocorda, che in parte determina le successive anomalie nei somiti, come mostrato qui. Mentre i controlli non trattati presentano una forma a chevron ben definita, i somiti trattati con etanolo assumono l'aspetto a U osservato in seguito alla riduzione del segnale di sonic hedgehog. Come si può vedere qui.

Un'altra conseguenza dell'esposizione all'etanolo, probabilmente successiva al ritardo dello sviluppo iniziale e ai difetti di Noor, è la riduzione della lunghezza dell'embrione. Questo risultato ricorda la persistenza della statura ridotta pre-puberale osservata nei bambini esposti all'etanolo durante lo sviluppo, suggerendo che il modello di pesce zebra sia rilevante per comprendere questo difetto congenito umano. È stato dimostrato in modelli animali che un'esposizione grave all'etanolo porta a fenotipi pronunciati del sindrome alcolica fetale, inclusi sintia e opia.

Nel pesce zebra, la distanza intraoculare o IOD diminuisce in modo dipendente dalla dose di etanolo, in linea con la natura del difetto congenito umano. L'opìa si osserva soltanto con dosi molto elevate, ma dosi più basse producono comunque una riduzione significativa dell'IOD, suggerendo che questo modello animale presenti un difetto simile nello sviluppo facciale mediano. In questa figura, i livelli precoci di espressione genica di six three B e glee one vengono confrontati in embrioni non trattati e trattati con etanolo.

Entrambi i geni hanno mostrato livelli ridotti di espressione nei campioni trattati con etanolo. Utilizzando l'ibridazione NC due ibrida, i modelli di espressione di sei tre B e gooID sono stati analizzati come osservato. In questo caso, entrambi i geni hanno mostrato una diminuzione dell'espressione spaziale negli embrioni trattati con etanolo rispetto ai controlli non trattati.

Poiché entrambi i geni sono espressi in tessuti destinati a diventare tessuti mediani craniofacciali, la loro riduzione otto ore dopo la fecondazione è coerente con la riduzione dell'IOD in fasi successive dello sviluppo. Una volta identificati i geni influenzati dall'etanolo, esistono meccanismi attraverso cui la loro espressione può essere aumentata o diminuita. In questo esempio, è stato iniettato mRNA per sonic hedgehog, un ligando che aumenta i livelli di glee one, il quale ha ripristinato i difetti macroscopici causati dalla riduzione di glee one negli embrioni trattati con etanolo.

L'iniezione di sei tre B, tuttavia, non è stata in grado di ripristinare il fenotipo esposto all'etanolo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come esplorare i difetti genetici e lo sviluppo provocati dall'etanolo in un embrione di pesce zebra in via di sviluppo. Le tecniche utilizzate in questo contesto possono essere applicate anche a coloro che desiderano studiare la tossicità di altri composti solubili in acqua sui vertebrati in via di sviluppo.