A High Throughput In situ Metodo di ibridazione di caratterizzare gli schemi di espressione di mRNA del mouse fetale basso tratto urogenitale

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare i modelli di espressione dell'mRNA nei tessuti fetali in via di sviluppo del tratto urogenitale inferiore del topo. Questo viene ottenuto innanzitutto sintetizzando una sonda ribonucleotidica marcata con digossigenina a partire da un template generato mediante PCR. Il secondo passaggio della procedura consiste nel produrre sezioni spesse utilizzando un microtomo a vibrazione.

Il terzo passaggio consiste nell'eseguire un'ibridazione in situ su sezioni del tratto urogenitale inferiore contenute in cestelli personalizzati. Gli mRNA vengono visualizzati mediante rilevamento immunoistochimico delle sonde a RNA legate, utilizzando il substrato BM purple precipitante per la fosfatasi alcalina. Infine, la microscopia può mostrare la localizzazione spaziale e temporale di trascritti mRNA a bassa e alta abbondanza nel tratto urogenitale inferiore del topo fetale.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'immunohistochimica è che le sonde ribo sono facili da generare e possono essere progettate per riconoscere la maggior parte degli mRNA nell'intero genoma del topo. Sebbene questo metodo fornisca informazioni sui modelli di espressione degli mRNA durante lo sviluppo genito-urinario fetale del topo, può essere applicato anche ad altri sistemi organici, specie e stadi di sviluppo. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché l'inclusione del tessuto nell'auger può risultare difficile da apprendere e perché piccole variazioni nell'orientamento possono portare a risultati non uniformi. Almeno un giorno prima della preparazione del tessuto, rimuovere e scartare la membrana da una piastra per colture cellulari milli di diametro di 12 millimetri, mentre l'anello rimanente fungerà da stampo; lasciare in ammollo gli anelli per tutta la notte in una soluzione inibitrice di RNAsi.

Nel giorno del protocollo, dissezionare il tratto urogenitale inferiore di un topo che è stato reidratato con metanolo in gradiente. Dopo lavaggi con PBS tween, scartare circa due terzi della vescica e conservare il tessuto rimanente del tratto urogenitale inferiore in PBS tween. Posizionare ora un stampo ad anello trattato su un vetrino di vetro e riempirlo con una soluzione al 4% di agarosio a basso punto di fusione a 62 gradi Celsius, lasciando raffreddare per circa due minuti.

Ora, bloccare e asciugare il tessuto del tratto urogenitale inferiore e immergerlo nella soluzione di agarosio. Utilizzare pinzette per orientare il tessuto in modo che rimanga sospeso a metà strada tra la parte superiore e quella inferiore dell'anello. Incubare in coltura a quattro gradi Celsius fino a quando l'agarosio si sarà solidificato.

Prima di sezionare il tessuto, preparare una lama Wilkinson personalizzata sciacquandola con solventi, seguiti da acqua. Separare la lama doppia longitudinalmente in due lame singole. Successivamente, sostenere la lama Wilkinson con una lama per microtomo.

Per fare ciò, innanzitutto tagliare la lama del microtomo alla lunghezza della lama Wilkinson. Quindi, utilizzando una colla adesiva Lock Tite, incollare la lama del microtomo alla lama Wilkinson sfalsandola rispetto al bordo tagliente di circa tre o quattro millimetri. Ora montare la lama rinforzata nel microtomo vibrante e impostare l'angolo della lama a 35 gradi.

Preparare il bagno per campioni di lusso riempiendo il bagno con PBS e disponendo del ghiaccio bagnato attorno ad esso. Prima di montare il tessuto incluso nel tappo, rimuoverlo dallo stampo ad anello e asciugare delicatamente la superficie inferiore. Quindi incollare la superficie asciutta al disco di montaggio utilizzando adesivo Loctite.

Inserire il disco nel vibratomo e regolare lo spessore della sezione a 50 micron, la velocità a due e l'ampiezza della lama a quattro. Durante il taglio delle sezioni di tessuto, utilizzare pinze smussate per trasferire ciascuna sezione in una piastra da coltura a 24 pozzetti riempita con mezzo millilitro di PBS tween ghiacciato. Dopo il taglio, rimuovere la maggior parte dell'aros intorno a ciascuna sezione di tessuto utilizzando forbici a molla prima di iniziare l'ibridazione INI; le sezioni possono essere conservate fino a 48 ore a quattro gradi Celsius in PBS tween contenente azide di sodio 2 millimolare.

Per prima cosa, preparare dei contenitori personalizzati per campioni tagliando il fondo di una provetta da microcentrifuga al segno di 100 microlitri. Riscaldare il bordo tagliato della provetta in una fiamma fino a quando la plastica diventa morbida. Quindi premere saldamente la plastica ammorbidita su un quadrato di rete metallica.

Lasciarlo indurire e tagliare la rete in eccesso. Completare i cestelli utilizzando un ago caldo da 18 gauge per forare due fori in ciascun tappo del tubo. Preparare un vassoio per contenere i cestelli del campione praticando 24 fori da 12 millimetri equidistanti nel coperchio di una piastra a 24 pozzetti.

Ogni foro deve essere posizionato direttamente sopra una pozzetta prima di iniziare a preriscaldare una camera di ibridazione coperta, riempita con mezzo pollice di acqua di rubinetto, fino a 60,5 gradi Celsius. Iniziare l'ibridazione in situ aggiungendo due millilitri di PBS tween in ciascuna pozzetta della piastra da coltura a 24 pozzette. Coprire questa piastra con il coperchio preparato, caricato con i cestelli.

Trasferire ora le sezioni di tessuto nei cestelli a temperatura ambiente, incubando con agitazione in perossido di idrogeno al 6% in PBS tween, seguito da una serie di lavaggi con PBS tween, un'incubazione con proteinasi K, un'ulteriore fissazione e altri lavaggi. Per completare la preparazione dei campioni, aggiungere due millilitri di tampone di pre-ibridazione preriscaldato in ciascun pozzetto e incubare la piastra all'interno della camera di ibridazione riscaldata per almeno un'ora. Avviare l'ibridazione aggiungendo 0,5 microgrammi di sonda RIBA marcata a ciascun pozzetto.

Bene, proseguire l'incubazione tutta la notte all'interno della camera riscaldata per ibridazione. Il giorno successivo, lavare i tessuti con la soluzione uno, passando gradualmente alla soluzione due, quindi trattare con RNA. Successivamente, lavare nella soluzione tre, seguito da lavaggi in TBS tween e tampone di bloccaggio del tessuto, mentre i tessuti sono in incubazione nel tampone di bloccaggio del tessuto.

Iniziare un'incubazione di almeno due ore dell'anticorpo anti-dig nel buffer di assorbimento degli anticorpi a quattro gradi Celsius dopo il periodo di incubazione. Centrifugare la soluzione anticorpale a 10.000 giri al minuto per un minuto. Per rimuovere i componenti insolubili, aggiungere la Senna a due millilitri di soluzione anticorpale in buffer.

Ora rimuovere il tessuto dal buffer di blocco e incubarlo nella soluzione di anticorpo preparata. Mantenerli in una camera di ibridazione tutta la notte a quattro gradi Celsius nel terzo giorno della procedura. Lavare i tessuti diverse volte in TBST con l'ole.

Quindi, utilizzando una pipetta di vetro per pasta, trasferire con attenzione i tessuti in provette microcentrifuga pulite. Lavare i tessuti per 10 minuti con un millilitro di NTM vuoto.

Quindi sostituire la soluzione con TMT contenente lava sole MBM viola. Collocare i tubi al buio e nei giorni successivi monitorare lo sviluppo del colore e cambiare la soluzione secondo necessità. Dopo lo sviluppo completo del colore, lavare brevemente i tessuti con TMT contenente lava so e poi incubarli tutta la notte a quattro gradi Celsius in PBS contenente paraformaldeide.

Il giorno successivo, trattare i tessuti con candeggina e lavarli. Le sezioni sono ora pronte per l'analisi mediante imaging. Il tessuto del tratto urogenitale inferiore è stato incluso in agar in modo che la linea mediana uretrale fosse parallela alla superficie piana del tappo di agarosio.

Questa orientazione ha prodotto sezioni sagittali. Appositi cestelli per campioni proteggevano le sezioni di tessuto delicate da polvere e particelle. Durante la procedura di ibridazione in situ a due ibridi di più giorni.

Hanno inoltre impedito la perdita di eventuali sezioni. È difficile ridurre al minimo la colorazione di fondo durante le lunghe incubazioni necessarie per rilevare mRNA a bassa abbondanza. Tuttavia, l'aggiunta di azoturo di sodio e la successiva filtrazione sembrano aver limitato la colorazione di fondo.

Inoltre, non sono state osservate differenze visibili nella colorazione di fondo quando i campioni sono stati incubati nella soluzione di sviluppo del colore per periodi di tempo prolungati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in sei giorni se eseguita correttamente. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come l'immunohistochimica possono essere eseguiti per determinare se il profilo di espressione degli mRNA corrisponde al profilo di espressione delle proteine.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare i modelli di espressione dell'mRNA e lo sviluppo del tratto genitale inferiore del topo.