Superare blocco nel encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) ceppi di topi resistenti dal trasferimento adottivo e uno stimolo antigenico

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre in modo costante e semplice l'EAE in qualsiasi ceppo di topo, inclusi quelli considerati resistenti all'induzione dell'EAE. Questo risultato si ottiene innanzitutto immunizzando topi donatori con proteine specifiche della mielina o antigeni peptidici, emulsionati in adiuvante completo di Freund. Dieci giorni dopo, i linfonodi dei topi donatori vengono isolati e le cellule linfonodali vengono nuovamente stimolate in vitro coltivandole con lo stesso antigene per quattro o cinque giorni.

Le cellule vengono quindi trasferite in modo adottivo in topi ricettori naïve. I ceppi di topi suscettibili svilupperanno EAE in otto-quattordici giorni per indurre EAE in un ceppo resistente. Quattordici giorni dopo il trasferimento adottivo, i topi ricettori sono stati quindi immunizzati con l'antigene in CFA.

Utilizzando questo metodo, l'EAE può essere indotta in ceppi di topi resistenti. Il principale vantaggio del protocollo di trasferimento e sfida adattativo per l'induzione dell'EAE è che consente un'induzione affidabile della malattia. Di rado osserviamo un tasso di malattia clinica inferiore al 100%.

È possibile adattare il protocollo per indurre la malattia e utilizzarlo con ceppi murini suscettibili, ma, cosa ancora più importante, possiamo impiegare questo protocollo per indurre l'EAE in numerosi ceppi murini precedentemente considerati resistenti alla malattia. Dimostrazione delle procedure. Oggi il nostro ricercatore principale è cha ching.

Iniziare preparando una soluzione di MBP a due milligrammi per millilitro in PBS. Utilizzare una siringa in vetro macinato dotata di blocco a baionetta per aspirare 100 microlitri di soluzione antigene per ogni topo da immunizzare.

Utilizzando una siringa separata, prelevare un volume uguale di adiuvante di Freud completo H 37 ra. Quindi, con un rubinetto a tre vie, collegare le due siringhe e spingere avanti e indietro gli stantuffi per mescolare l'antigene e l'adiuvante fino a formare un'emulsione. Per verificare che ciò sia avvenuto, trasferire la soluzione in una delle siringhe e scollegare quella vuota.

Estrarre leggermente indietro lo stantuffo delle siringhe vuote, quindi rilasciare una goccia della miscela residua in un becher contenente acqua pulita a temperatura ambiente. Se la goccia si disperde, ricollegare le siringhe e continuare a mescolare. Ripetere il test se la goccia rimane integra e si è formata un'emulsione, per raccogliere l'emulsione.

Per l'immunizzazione. Collegare una siringa di plastica da un millilitro alla siringa di vetro dalla quale è stato rimosso lo stantuffo. Trasferire con attenzione la soluzione nella siringa di plastica, riempiendola fino al bordo.

Quindi inserire lo stantuffo in plastica ed espellere parte dell'emulsione in modo che rimangano esattamente 1,2 millilitri. Non devono essere presenti bolle d'aria intrappolate nella siringa. Se questa procedura viene eseguita correttamente.

Staccare la siringa di plastica. Montare un ago da 26 gauge e riempire il volume morto dell'ago spingendo lo stantuffo fino al segno di un millilitro. Afferrare saldamente il topo per la nuca e tenere la coda all'indietro tra l'anulare e il mignolo in modo che torace e addome siano facilmente accessibili. Per via sottocutanea.

Iniettare 50 microlitri di emulsione nel torace subito sopra l’ascella destra. Se l’iniezione viene eseguita correttamente, si formerà un piccolo rigonfiamento bianco visibile nel sito di iniezione. Ripetere la procedura sopra l’ascella sinistra, quindi rilasciare la coda e afferrare la zampa destra, esponendo il fianco destro del topo.

Iniettare 50 microlitri di soluzione appena al di sotto della gabbia toracica. Lasciare la zampa posteriore destra. Ruotare il topo nel verso opposto e ripetere l'iniezione sul lato sinistro.

Sette-dieci giorni dopo l'immunizzazione, prelevare i linfonodi dagli animali soppressi. Posizionare innanzitutto il topo sulla schiena, con gli arti distesi e fissati al tavolo di dissezione mediante puntine.

Spruzzare l'etanolo sul topo. Quindi, utilizzando strumenti sterili, praticare un'incisione longitudinale sulla pelle del topo, partendo dall'addome inferiore fino al mento.

Eseguire un'altra incisione dall'addome lungo una gamba, quindi lungo l'altra. Staccare la pelle dal topo e fissarla al tavolo da dissezione.

Tagliare anche la pelle lungo i quattro arti. Poi staccare e fissare con dei perni la parte superiore delle lemba di pelle su entrambi i lati; i linfonodi inguinali e ascellari, che normalmente si trovano vicino all'inguine o alle ascelle, dovrebbero essere visibili come piccole masse opache direttamente sotto la pelle. Utilizzare due pinzette fini per rimuovere delicatamente il tessuto connettivo sovrastante il primo linfonodo.

Avendo cura di non danneggiare i vasi sanguigni nel corso dell'operazione. Una volta rimossi i tessuti connettivi, posizionare una coppia di pinzette sotto il linfonodo ed estrarlo delicatamente dal corpo. Trasferire il linfonodo in una piastra di Petri da 35 millimetri contenente PBS sterile e raccogliere gli altri tre linfonodi nello stesso modo.

Dopo aver prelevato tutti i linfonodi, trasferire la piastra di Petri in una cappa a sicurezza biologica. Utilizzando la parte posteriore dello stantuffo di una siringa sterile, omogeneizzare i linfonodi per liberare le cellule; per rimuovere i detriti, filtrare la sospensione attraverso una maglia di nylon in un tubo conico.

Quindi portare il volume a 50 millilitri con PBS sterile e centrifugare le cellule per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, risospendere le cellule in un piccolo volume di mezzo di coltura cellulare preriscaldato e contare le cellule vitali. Regolare la concentrazione a quattro volte 10 alla sei cellule per millilitro.

Quindi si piastrano le cellule a due millilitri per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. Si aggiunge l'antigene MVP in ogni pozzetto in modo da ottenere una concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro. Una volta aggiunto l'antigene.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per cinque giorni. Una volta che le cellule sono state ri-stimolate, raccoglierle pipettando delicatamente su e giù e trasferirle in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare le cellule a 1000 giri al minuto per 10 minuti e risospendere il pellet in un piccolo volume di PBS sterile.

Quindi contare le cellule e regolare la concentrazione di cellule vitali a 2,5 × 10⁸ cellule per millilitro con PBS. Aspirare le cellule in una siringa e applicare un ago da 26 gauge per eseguire il trasferimento adottivo. Iniettare 0,2 millilitri di cellule per via endovenosa nella coda di ciascun topo per sfidare i topi resistenti a settimane successive al trasferimento adottivo.

Iniettare negli animali 200 microgrammi di antigene in un volume di 200 microlitri di emulsione, nello stesso modo in cui è stata eseguita l'immunizzazione nei topi donatori. Da sette a dieci giorni dopo la sfida, si svilupperà una malattia paralitica, la cui progressione può essere monitorata. La malattia inizia con un'indebolimento della coda.

Quando la coda è flaccida, la malattia viene classificata al grado uno. Il grado due viene assegnato se il topo sviluppa paralisi in un arto posteriore, e il grado tre se entrambi gli arti posteriori sono paralizzati. Il grado quattro corrisponde alla paralisi di entrambi gli arti anteriori.

Grado cinque, il topo è più abbondante. E grado sei, il topo è morto. Come mostrato qui, da sette a 14 giorni dopo la sfida, i topi svilupperanno una malattia paralitica monofasica, che può essere valutata utilizzando i criteri classici di EAE.

Sebbene i topi possano riprendersi, non andranno incontro a recidiva spontanea. L'induzione della malattia richiede una sfida specifica per l'antigene. La sfida con CFA da solo o con un antigene irrilevante non induce la malattia.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione del metodo di trasferimento adottivo e di sfida per indurre l'EAE. Combinando il trasferimento adottivo di cellule dei linfonodi specifiche per l'antigene con una sfida antigenica di richiamo, è possibile indurre facilmente l'EAE in qualsiasi ceppo di topo. Questo metodo ci permette di superare i meccanismi di resistenza intrinseci in alcuni ceppi di topi, consentendo quindi lo studio della resistenza alla malattia. Inoltre.

Questa tecnica dovrebbe essere facilmente adattabile per lo studio di qualsiasi processo di malattia autoimmune.