Endurance Training protocollo e saggi prestazioni longitudinali per Drosophila melanogaster

L'obiettivo del seguente esperimento è addestrare Dsof e Melanogaster mediante un nuovo programma di esercizio aerobico e valutare gli effetti dell'allenamento fisico. Questo viene ottenuto utilizzando un dispositivo automatizzato che solleva e abbassa ripetutamente diversi tubi contenenti moscerini, attivando così ripetutamente la risposta istintiva di arrampicata degli insetti e fornendo loro una sessione di allenamento. I moscerini vengono allenati quotidianamente secondo un programma progressivo che prevede da due a tre ore al giorno per un periodo di allenamento della durata di tre settimane.

Successivamente, i moscerini vengono sottoposti a diversi test comportamentali al fine di misurare gli effetti dell'esercizio. I risultati mostrano che i moscerini sottoposti a esercizio salgono più rapidamente, come misurato dal saggio di repulsione geotattica negativa rapida o saggio dell'anello. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'allenamento per l'endurance in altri animali, è la vasta disponibilità di strumenti per la manipolazione della genetica di Drosophila.

Nello studio dell'esercizio di resistenza, abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo mentre stavamo conducendo numerosi saggi di geotassi negativa singola. Ci siamo chiesti per quanto tempo le mosche potessero continuare ad arrampicarsi e se fosse possibile sottoporle a un allenamento di resistenza in questo modo. La torre di potenza è costruita su un pezzo rettangolare di compensato che viene fissato con morsetti a un tavolo.

Un motore elettrico a 4,5 rotazioni al minuto poggia su diverse assi ed è collegato a un regolatore di velocità, un fusibile e un interruttore di alimentazione. In una scatola di giunzione, un ventilatore di tre pollici tenuto all'interno di un tubo metallico è orientato verso il motore per il raffreddamento.

Collegato al motore c'è un braccio rotante con un rullo. All'estremità, il motore e il braccio ruotano spingendo verso il basso un lato di un'asta piegata collegata al compensato. Con una cerniera da porta sull'altro lato dell'asta, una ruota è fissata in modo che possa rotolare contro una piattaforma.

Si muove verso l’alto e verso il basso mentre il motore ruota; la potenza del motore è regolata in modo che un intero periodo di rotazione duri 15 secondi. Sulla piattaforma, i portaprovetta per Drosophila sono fissati con cordini elastici, e le provette inserite in questi supporti sono bloccate con una rete fissata anch’essa alla piattaforma. Grazie ai cordini elastici, la piattaforma può scorrere verso l’alto e verso il basso lungo guide standard e un cuscinetto in polistirolo smorza l’impatto della caduta. La torre di alimentazione è gestita in una stanza a temperatura controllata, per corrispondere alle condizioni in cui gli animali vengono allevati.

Per eseguire un esperimento sull'esercizio fisico, sono necessari almeno 240 moscerini maschi di età comparabile per il monitoraggio longitudinale dell'endurance e dell'abilità motoria, nota anche come risposta all'asse geotattico negativo o capacità di arrampicata. Mantenere i moscerini in popolazioni di 20 per provetta. Dividere le provette in due gruppi di uguale dimensione, uno dei quali verrà sottoposto a esercizio; le provette di questo gruppo devono essere chiuse con tappi di sughero, mentre il gruppo di controllo deve essere chiuso con tappi di spugna.

Una spugna viene utilizzata per l'immobilizzazione perché la sua dimensione adattabile permette un facile posizionamento vicino al fondo della provetta. Il materiale più morbido della spugna riduce inoltre le lesioni causate dai flugs più solidi. Le provette contenenti il cibo devono essere sostituite ogni due giorni prima del test.

Durante l'addestramento, le mosche rimangono nei vial di cibo perché, se si utilizzano vial vuoti, molte più mosche subiscono lesioni legate all'addestramento. Quando si caricano i vial delle mosche di controllo sulla torre di potenza, premere i tappi di spugna fino a circa tre millimetri sopra il livello del cibo, limitando così le mosche.

Movimento per risultati costanti. Testare entrambi i gruppi di moscerini per cinque giorni consecutivi a settimana, utilizzando un programma graduale che aumenta la durata della sessione da due a tre ore al giorno nell'arco di un periodo di tre settimane. Ovviamente, si potrebbe adottare qualsiasi regime.

La coerenza nel trattamento, nell'orario della giornata e nei metodi di saggio durante un arco temporale di tre settimane è essenziale. Una pianificazione accurata e procedure pratiche riducono la possibilità di errori e affaticamento. I saggi possono essere eseguiti in modo longitudinale su moscerini prima, dopo o durante il regime di addestramento.

È inoltre possibile utilizzarlo per ottenere una risposta più sicura a una variabile ambientale. Eseguire il saggio di affaticamento in un giorno in cui non viene svolta l'addestramento. All'inizio della giornata, caricare entrambi i gruppi di moscerini sulla torre di alimentazione.

Attivare l'apparato e osservare ogni provetta ogni 10 minuti. Se in quattro gocce consecutive, cinque o meno moscerini in una provetta salgono a più di due pollici di altezza, allora quella coorte di moscerini è considerata affaticata. Rimuovere i moscerini affaticati dalla torre di potenza mentre è ancora in funzione e registrare l'orario della rimozione.

Osservare tutti i viali per un massimo di 10 ore e compilare i risultati. Un saggio per la quantificazione. Gli effetti dell'allenamento consistono in una misurazione giornaliera della velocità di corsa, che può essere eseguita per tutta la durata del regime di allenamento e oltre.

Per misurare l'effetto a lungo termine dell'addestramento. Per iniziare il test della velocità di arrampicata o il test dell'anello, trasferire innanzitutto le mosche in nuovi tubi vuoti e posizionare una fila di sei tubi in un portatubi. Pezzi di nastro arrotolati vengono utilizzati per fissare i tubi al portatubi.

Quindi posizionare il rack davanti a una sorgente luminosa, come una bacheca per lastre radiografiche che fornisca un'illuminazione uniforme delle provette. Ora configurare una fotocamera per fotografare il rack in modo che la posizione di ciascuna mosca sia visibile in ogni provetta. Successivamente, battere leggermente sulle sei provette per far cadere tutte le mosche sul fondo e scattare una fotografia cronometrata.

Dopo due secondi dal momento in cui tutti i moscerini sono stati abbattuti. Se si utilizza il flash della fotocamera, occorre farlo in modo costante. Ripetere questo procedimento quattro volte per ogni serie di viali prima di procedere con la power tower.

Per analizzare i dati, assegnare un punteggio a ciascuna foto individualmente utilizzando un software per individuare i margini superiore e inferiore del vial. Successivamente, misurare l'altezza raggiunta da ciascuna mosca nell'arrampicata. Quindi, copiare le altezze raggiunte nell'arrampicata su Excel.

A ciascun moscerino in ciascun provetta viene assegnato un punteggio da zero a quattro corrispondente all'altezza del quadrante raggiunto: quattro per il quadrante più alto e zero se non risale affatto. Per ogni provetta, calcolare il punteggio di ciascuno dei 20 moscerini e determinare il punteggio medio del gruppo.

Questo è chiamato indice di arrampicata. Per l'analisi dei dati si utilizza la media dei quattro indici di arrampicata di ciascun gruppo in quel giorno. Se non è disponibile un software di elaborazione delle immagini, è possibile tracciare delle linee di quadrante sui tubi vuoti e assegnare manualmente ai moscerini i valori di quadrante, mentre i moscerini di tipo selvatico hanno risposto a un protocollo di resistenza con un ridotto declino legato all'età nella capacità di arrampicata.

Questo persisteva al termine dell'addestramento, come evidenziato da saggi longitudinali ad anello nell'arco di cinque settimane di età. Pertanto, l'induzione dell'esercizio mediante il programma della power tower può essere utilizzata come input comportamentale e può essere valutata la capacità di fattori genetici o ambientali di modulare tale effetto. Al contrario, la power tower può essere utilizzata anche come output.

Ad esempio, quando moscerini con una percentuale variabile di saccarosio nella dieta sono stati sottoposti al test del tempo di affaticamento, un contenuto maggiore di saccarosio si è correlato con una maggiore capacità di resistenza. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante assicurarsi che tutti i gruppi di moscerini abbiano la stessa età e che i metodi vengano eseguiti in modo costante durante l'intero esperimento.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come allenare, mantenere e valutare moscerini di qualsiasi genotipo.