Isolamento di oligomeri PrP solubili e insolubili nel cervello umano normale

Lo scopo di questa procedura è isolare la frazione proteica solubile e insolubile di pion o PRP da tutti i legamenti nel cervello umano normale. Questo viene ottenuto prima omogeneizzando il tessuto cerebrale umano e isolando le frazioni. Successivamente, viene eseguita una sedimentazione per velocità in gradienti a gradini di saccarosio.

Successivamente viene effettuata una cromatografia a esclusione molecolare. Infine, il PRP viene isolato mediante la proteina genica cinque o G cinque P. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano l'isolamento di PRP o legamenti solubili e insolubili dal cervello umano normale attraverso ultracentrifugazione in gradienti discontinui di saccarosio, cromatografia a esclusione molecolare e cattura del PRP con G cinque P. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella ricerca sulle malattie da prioni, tra cui la malattia di Creutzfeldt-Jakob, l'encefalopatia spongiforme bovina e le malattie da cachessia clinica. Inoltre, può fornire informazioni sull'isolamento di proteine ogas solubili e insolubili, non solo per le malattie da prioni, ma anche per altre patologie come la malattia di Alzheimer e il morbo di Parkinson.

Generalmente, le persone alle prime armi con questi metodi incontreranno difficoltà poiché tutti i passaggi sperimentali sono importanti e richiedono particolare attenzione. La dimostrazione video di questa procedura è fondamentale, poiché la SEC Fi presenta una profondità notevole e il recupero del PRP con G cinque P risulta complesso da descrivere ed è possibile che risulti impreciso senza un'operazione più accurata. Per preparare un omogenato cerebrale, iniziare aggiungendo 100 microlitri di buffer di lisi a 100 milligrammi di tessuto cerebrale congelato utilizzando un pestello motorizzato, omogeneizzare il tessuto su ghiaccio, congelarlo su ghiaccio secco per cinque minuti e quindi omogeneizzare nuovamente.

Preparare un omogenato totale del cervello al 20% o al 10% aggiungendo rispettivamente 300 o 800 microlitri di buffer di lisi. Utilizzando una centrifuga da banco, centrifugare l'omogenato a 1000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere la frazione SNA in una centrifuga con rotore S SW 55 e centrifugare tale frazione a 35.000 giri al minuto per un'ora a quattro gradi Celsius.

Trasferire il soprannatante in un tubo pulito per la risospensione. Sospendere il pellet insolubile nel detergente nel buffer di lisi per preparare i campioni per il western blot. Incubare le frazioni S due e P due con 50 microgrammi per millilitro di proteinasi K per un'ora a 37 gradi Celsius.

Terminare la digestione aggiungendo PMSF a 5 millimolari e buffer campione SDS. Far bollire i campioni per 10 minuti e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente per cinque minuti. Per eseguire la sedimentazione di velocità, iniziare incubando 450 microlitri della frazione 20%S uno con un volume uguale di acqua 2%Sarco X su ghiaccio per 30 minuti in provette da centrifuga da cinque millilitri. Aggiungere 0,5 millilitri ciascuno di saccarosio al 60, 30, 25, 20, 15 e 10%, quindi caricare 0,4 millilitri dell'S uno incubato sulla sommità del gradiente di saccarosio dal 10 al 60%.

Centrifugare i gradienti a gradino in un rotore SW 55 a 48.000 giri/min per un'ora a quattro gradi Celsius partendo dalla sommità del tubo. Raccogliere 12 frazioni uguali da 283 microlitri ciascuna. Utilizzare 20 microlitri di ogni frazione e un volume uguale di tampone campione SDS.

Per preparare i campioni per gel SDS-PAGE. Far bollire i campioni per 10 minuti, quindi raffreddarli per quattro minuti. Centrifugare i campioni a 1000 ×g per un minuto.

Quindi vorticare prima di caricarli su un gel preformato per esclusione dimensionale. La cromatografia viene utilizzata per determinare lo stato oligomerico delle molecole di PRP. Iniziare caricando volumi di campione di 200 microlitri di sette marcatori individuali di massa molecolare su una colonna di dimensioni 1 per 30 contenente perle SUEx 200 HR.

Utilizzare il volume eluente del dextrano blu come volume di esclusione. Calcolare i volumi eluenti di picco di VE dal cromatogramma e dalle ritenzioni frazionarie. Calcolare il coefficiente di partizione KAV utilizzando l'equazione KAV uguale a V meno V zero fratto VT meno V zero.

Per generare una curva di calibrazione, riportare su grafico il KAV dei campioni proteici rispetto al logaritmo del peso molecolare dei campioni. Successivamente, applicare 200 microlitri di S uno sulla colonna a una velocità di flusso di 0,25 millilitri al minuto.

Lavare la colonna con 1% del tampone di lisi e, utilizzando un raccoglitore di frazioni, eluire frazioni da 0,25 millilitri. Incubare 125 microlitri di ogni frazione con 500 microlitri di metanolo pre-raffreddato a meno 20 gradi Celsius per due ore. Centrifugare i campioni a 13.000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Reese, risospendere il pellet in 20 microlitri di tampone campione SDS e bollire per 10 minuti. Portare a temperatura ambiente e separare su gel di poliacrilammide al 15%. Utilizzare la curva standard per estrapolare i pesi molecolari delle diverse specie di PRP recuperate per coniugare la molecola G cinque P alle perle magnetiche.

Incubare 100 microgrammi di G cinque P con 350 microlitri di toci attivati su perle magnetiche in un millilitro di PBS a 37 gradi Celsius per 20 ore. Utilizzare un magnete esterno per attirare le perle di G cinque P sulla parete laterale delle provette eppendorf e rimuovere la soluzione. Lavare le perle tre volte con un millilitro di PBS 0,1% BSA per bloccare il legame non specifico.

Incubare le perline coniugate con G cinque P in un millilitro di tris 0,2 molare, HCl pH 7,4 contenente lo 0,1% di BSA per cinque ore a 37 gradi Celsius. Lavare quindi le perline tre volte. Rimuovere l'ultimo lavaggio e aggiungere un millilitro di PBS per isolare PRP; incubare 100 microlitri di S uno o P due con 60 microlitri di perline coniugate con G cinque B in un millilitro di buffer di legame sotto rotazione costante per tre ore a temperatura ambiente.

Posizionare il tubo sul magnete. Rimuovere la soluzione e lavare le perle tre volte con il buffer di lavaggio. Rimuovere l'ultimo lavaggio e aggiungere il buffer campione SDS.

Riscaldare le perle a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Caricare i campioni su gel preformati al 15% ed eseguire a 150 volt per circa 80, 80 minuti. Trasferire le proteine su PVDF a 70 volt per due ore dopo aver bloccato le membrane in latte al 5% in TBST.

Incubarli per due ore a temperatura ambiente con gli anticorpi PRP. Tre F quattro uno E quattro anti N o anti C, dopo l'incubazione con anticorpi secondari coniugati con HRP, incubare la membrana e la soluzione chemiluminescente seguendo le istruzioni del produttore ed esporre la pellicola come mostrato qui. Rispetto ai campioni sporadici di malattia da valvola CRUT jaakko o malattia di CJD, è stata rilevata una piccola quantità di PRP cellulare insolubile nella frazione P due proveniente da cervelli normali.

Tuttavia, la maggior parte è stata recuperata nella frazione S2. Il PRP insolubile rappresenta circa dal 5 al 25% del PRP totale, inclusi gli analisi di specie a lunghezza intera e troncate a livello terminale. L'analisi mediante sedimentazione su gradiente discontinuo di saccarosio ha rivelato che, mentre la maggior parte del PRPC proveniente da cervelli non affetti da CJD era recuperata nelle frazioni superiori, piccole quantità di PRP sono state inoltre rilevate nelle frazioni inferiori (9-11), che normalmente contengono aggregati di grandi dimensioni. Una varietà di specie patogeniche di PRP o PRP SC, che vanno da monomeri.

Legamenti più piccoli e aggregati più grandi sono stati isolati mediante filtrazione su gel nel cervello con valvola CRUT in seguito alla malattia di Yakup. Sorprendentemente, è stata riscontrata anche una piccola quantità di aggregati più grandi con un peso molecolare superiore a 2000 chilodalton nelle frazioni insolubili dei cervelli normali. Inoltre, i dimeri e i tetrameri della PRPC sono stati rilevati non solo nelle frazioni insolubili, ma anche in quelle insolubili.

Dopo il trattamento con PK e P NGAs. Il PRP catturato da G cinque P è stato rilevato con l'anticorpo uno E quattro anti-PRP 97 1 0 5 3. I frammenti centrali resistenti alla PK, denominati PRP asterisco 20, PRP asterisco 19 e PRP asterisco sette, sono stati rilevati in migrazione a 20 kilodalton, 19 kilodalton e 7 kilodalton rispettivamente.

Tuttavia, nessun PRP è stato rilevato quando l'anticorpo one E four è stato preincubato con un peptide sintetico che ha una sequenza identica all'epitopo one E four, indicando che le bande rilevate dall'anticorpo one E four sono frammenti di PRP. L'anticorpo anti C ha rilevato due diversi frammenti di PRP che migrano a circa 18 kilodalton e a circa 12-13 kilodalton. Oltre al metodo PRP ETE 20.

Questa tecnica può essere eseguita in quattro giorni se viene effettuata correttamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare la PRP poligamosa solubile e insolubile nel cervello umano inferiore dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada alla ricerca sul destino dei precursori per esplorare informazioni sulla conformazione di PIP nel cervello.