Identificazione e isolamento di Slow-divisione delle cellule nel glioblastoma umano per mezzo di Carboxy fluoresceina succinimidile Ester (CFSE)

Questo protocollo video illustra l'identificazione e l'isolamento di cellule a divisione lenta nel glioblastoma umano mediante l'utilizzo del carbossifluoresceina SDI etere, CFSE. Le cellule tumorali del glioblastoma vengono inizialmente coltivate utilizzando il saggio in neurosfere. Successivamente, le sfere ottenute vengono dissociate in cellule singole e colorate con CFSE.

Le cellule caricate con CFSE vengono nuovamente seminate. Nella coltura di neurosfere, le sfere ottenute vengono dissociate in cellule singole ed analizzate mediante citometria a flusso. Le cellule con divisione lenta e rapida vengono identificate e separate in base all'intensità della fluorescenza in funzione della divisione cellulare.

L'eterogeneità della frequenza è una caratteristica essenziale del cancro. Questa eterogeneità sostiene la robustezza del tumore e rappresenta un grande ostacolo allo sviluppo di trattamenti completamente efficaci. È quindi fondamentale sviluppare strumenti e saggi per studiare e comprendere questa eterogeneità, definita geneticamente, fenotipicamente e funzionalmente.

In questo protocollo video, descriviamo un metodo consolidato che utilizza i flues e l'I-C-F-S-C. Questa tecnica consente l'identificazione e la separazione mediante citometria a flusso di singole sottopopolazioni all'interno di una coltura di cellule derivate da glioblastoma umano che possiedono diverse caratteristiche funzionali. Abbiamo utilizzato questa tecnica per isolare e caratterizzare una popolazione tumorale di cellule che mostrano un basso tasso di divisione, una proprietà funzionale che è stata associata all'insorgenza del tumore nei gliomi. La coltura di sfere tumorali viene stabilita e mantenuta utilizzando il saggio di neurosfera, descritto in un video separato all'indirizzo mostrato sullo schermo.

Quando le sferoidi di glioma raggiungono un diametro compreso tra 150 e 200 micron, il mezzo contenente le sferoidi viene rimosso e trasferito in un tubo sterile per colture cellulari di dimensioni adeguate, quindi centrifugato a 800 giri/min o 110 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, il soprannatante viene scartato e il pellet di sferoidi viene risospeso in un mL di tripsina-EDTA preriscaldata e incubato a 37 gradi in un bagnomaria per tre-cinque minuti. Viene quindi aggiunto un volume uguale di inibitore della tripsina, mescolando delicatamente su e giù con una pipetta per dissociare le sferoidi.

La sospensione cellulare viene nuovamente centrifugata. Il sopranatante viene rimosso e le cellule vengono risospese in un millilitro di mezzo basale per cellule staminali neurali. Per ogni milione di cellule da colorare, 10 microlitri della sospensione cellulare singola vengono accuratamente mescolati con 90 microlitri di triptano blu e viene effettuato un conteggio cellulare.

Un millilitro di reagente colorante viene preparato aggiungendo un microlitro di colorante CFSE a cinque millimolari a un millilitro di mezzo basale per cellule staminali neurali, ottenendo una concentrazione finale di colorazione di cinque micromolari. Successivamente, la soluzione di colorazione viene mescolata accuratamente. Il numero desiderato di cellule viene quindi trasferito in una provetta separata, centrifugato ed il sopranatante viene rimosso.

La soluzione di colorazione con CFSE viene quindi aggiunta al pellet e mescolata delicatamente fino a ottenere un'omogeneità, quindi incubata a temperatura ambiente per 10 minuti per arrestare il processo di colorazione. Vengono aggiunti da 5 a 10 volumi di mezzo basale per cellule staminali neurali freddo su ghiaccio alle cellule caricate con CFSE e mescolati accuratamente. La sospensione cellulare viene quindi centrifugata e il sopranatante viene scartato.

A questo punto, dovrebbe apparire un pellet di cellule sul fondo del tubo con una tinta verde che indica che la colorazione è stata eseguita con successo. Per rimuovere l'eccesso di colorante CFSE, si effettuano da due a tre lavaggi mediante risospensione del pellet in un millilitro di mezzo basale per cellule staminali neurali, centrifugazione e rimozione del soprannatante.

Dopo il terzo lavaggio, le cellule vengono risospese in un ml di mezzo basale per cellule staminali neurali e viene effettuato un conteggio cellulare come descritto in precedenza per la semina delle cellule. Il mezzo completo per cellule staminali neurali viene integrato con EGF a una concentrazione finale di 20 nanogrammi per ml. Successivamente, le cellule dai gruppi caricati e non caricati con CFSE vengono aggiunte rispettivamente ai loro tubi per raggiungere una concentrazione finale di 50.000 cellule per ml.

Successivamente, le sospensioni cellulari vengono mescolate accuratamente e seminate in flaconi sterili per coltura tessutale. I flaconi vengono quindi etichettati. Le cellule possono essere osservate al microscopio a fluorescenza per verificare la colorazione con CFSE e successivamente collocate in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per un periodo compreso tra cinque e dieci giorni.

Per verificare la colorazione con CFSE mediante citometria a flusso, 500.000 cellule dai gruppi di controllo negativo carichi e non carichi di CFSE vengono trasferite in provette FACS separate. Il citometro a flusso viene regolato secondo le istruzioni riportate nel manuale d'uso per i parametri correlati. Innanzitutto, vengono analizzate le cellule del controllo non carico e gli eventi vengono registrati in base alle proprietà di scattering anteriore e laterale; successivamente, in un istogramma basato sulla frequenza cellulare rispetto all'intensità di CFSE, la popolazione principale di cellule viene selezionata (gated) per verificare il livello di intensità della fluorescenza di CFSE.

Successivamente, le cellule caricate con CFSE vengono analizzate utilizzando gli stessi parametri impiegati per le cellule di controllo, come è evidente. Le cellule positive al CFSE mostrano un'intensità di fluorescenza che è di ordini di grandezza superiore rispetto alle cellule di controllo. Quando le sferoidi di glioma hanno raggiunto una dimensione media di circa 150-200 micron di diametro.

Le sfere vengono passaggiate e viene preparata una sospensione di singole cellule sia dai gruppi marcati che non marcati con CFSE, come descritto in precedenza. Successivamente, le cellule vengono risospese in un volume appropriato di PBS sterile 1x e viene effettuato un conteggio cellulare per escludere cellule morte o danneggiate. Durante l'ordinamento mediante citometria a flusso, viene aggiunto ioduro di propidio a una concentrazione di un microlitro per ml di sospensione cellulare per raccogliere le cellule che si dividono lentamente e quelle che si dividono rapidamente.

Durante il sorting, vengono preparate due provette sterili da 15 ml per coltura cellulare, ciascuna contenente un ml di mezzo completo per cellule staminali neurali. Successivamente, le cellule vengono poste sul ghiaccio durante il trasferimento al laboratorio di citometria a flusso. Innanzitutto, la sospensione cellulare del gruppo di cellule non marcate viene analizzata mediante citometria a flusso.

Gli eventi vengono tracciati in base allo scatter anterogrado rispetto allo scatter laterale per escludere cellule morte o danneggiate. Le cellule vengono tracciate in base allo scatter laterale rispetto alla reattività al PI e una singola popolazione di cellule vive viene selezionata come popolazione uno. Successivamente, una popolazione cellulare omogenea proveniente dalla popolazione uno viene selezionata in base alle proprietà di scattering anterogrado e laterale e delimitata come popolazione due; la popolazione due viene quindi rappresentata in un istogramma in base alla frequenza cellulare rispetto all'intensità di CFSE, impostata su scala logaritmica, utilizzando gli stessi parametri e strategia di gating.

Le cellule marcate con CFSE vengono analizzate mediante citometria a flusso. Successivamente, l'85% inferiore delle cellule viene selezionato come popolazione a rapida divisione e il 5% superiore viene selezionato come popolazione a lenta divisione. Queste diverse popolazioni cellulari di interesse vengono selezionate e ordinate in provette sterili da coltura tissutale da 15 ml contenenti un ml di mezzo completo per cellule staminali neurali.

La velocità di selezione deve essere regolata in modo da non superare 2.500 eventi al secondo. Al termine della selezione, le cellule vengono centrifugate, il soprannatante viene scartato e il pellet viene risospeso in un volume appropriato di mezzo e viene effettuato un conteggio cellulare. Successivamente, le cellule provenienti dalle diverse popolazioni selezionate vengono seminate a una densità di 50.000 cellule per ml.

In mezzo completo per cellule staminali neurali, integrato con 20 nanogrammi per ml di EGF, le cellule vengono quindi incubate da cinque a 10 giorni per far sviluppare sferoidi. Questo è un esempio di cellule. Poco dopo il caricamento con il colorante CFSE, tutte le cellule mostrano una fluorescenza verde intensa, come osservato al microscopio a fluorescenza.

Questa è un'immagine di una sfera di glioma rappresentativa derivata da cellule caricate con A-C-F-S-E, sei giorni dopo il seeding. Si noti che alcune cellule presentano ancora una colorazione CFSE molto intensa. Questo è un esempio di istogramma di citometria a flusso che mostra come l'intensità del CFSE decresca nel tempo.

Il blu rappresenta le cellule appena caricate con CFSE che mostrano un'intensità di fluorescenza. Tale intensità è di diversi ordini di grandezza superiore rispetto alle cellule non caricate, rappresentate in rosso. Il verde rappresenta l'intensità di fluorescenza ridotta dopo un periodo di sei giorni dal caricamento con CFSE, a causa della divisione cellulare.

Queste sono sfere rappresentative coltivate sette giorni dopo l'isolamento di popolazioni cellulari a divisione rapida e lenta. Le frequenze di formazione delle sfere non differiscono tra i due gruppi, ma le cellule che trattengono il CFSC si dividono più lentamente e danno origine a sfere più piccole rispetto alle cellule che diluiscono il CFSC. L'utilizzo del CFSC per identificare e isolare sottopopolazioni cellulari in base al tasso di divisione cellulare rappresenta un punto di partenza per esperimenti successivi e ulteriori caratterizzazioni.

Questo protocollo ha fornito un esempio per identificare cellule a divisione lenta in colture derivate da glioma umano, ma può essere applicato anche ad altri tipi di cellule tumorali o a sistemi non cancerosi. Grazie per aver guardato e speriamo che questo protocollo si sia rivelato utile per la vostra ricerca.