Ingegneria ed evoluzione del sintetico virus adeno-associato (AAV) Vettori Terapia genica attraverso la famiglia Shuffling DNA

L'obiettivo generale del seguente esperimento è creare una libreria altamente diversificata di capside virali adeno-associati sintetici, dalla quale si possano selezionare particelle dotate di una proprietà desiderata. Questo risultato si ottiene innanzitutto frammentando, clonando e selezionando geni del capside di un virus adeno-associato (aav) mediante digestione controllata del DNA con un'endonucleasi per permetterne successivamente il ripristino in sequenze chimere attraverso due reazioni di PCR. Come secondo passaggio, il prodotto di PCR risultante viene clonato nuovamente in un costrutto di aav dotato di capacità replicativa, generando così una libreria di plasmidi contenente almeno 1 milione di geni diversi del capside di aav.

Successivamente, questa libreria di plasmidi viene trasfettata in cellule 293T, insieme a un plasmide helper adenovirale, al fine di produrre una libreria di virus chimerici che può quindi essere selezionata su cellule bersaglio o in animali. I risultati mostrano l'ingegnerizzazione molecolare e l'evoluzione con successo di nuovi vettori AAV sintetici, basate sull'espressione potenziata o più specifica di geni reporter in cellule in coltura o in topi adulti. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la visualizzazione di peptidi, è che il DNA family shuffling ha la potenzialità di modificare e migliorare simultaneamente molteplici caratteristiche del capside AAV, dal legame cellulare e il traffico intracellulare fino allo smantellamento e all'espressione genica nel nucleo.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei settori della terapia genica e della virologia, ad esempio come ottenere un vettore ideale per una specifica applicazione terapeutica o come identificare i domini di un capside virale responsabili di una determinata proprietà. Le implicazioni di questa tecnica si estendono al trattamento di numerose malattie umane, comprese le infezioni da agenti patogeni virali, poiché il nostro metodo consente l'evoluzione molecolare di vettori AAV in grado di infettare in modo specifico e potente cellule bersaglio virali, come linfociti T per l'HIV o epatociti per i virus dell'epatite. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biologia degli AAV e possa essere utilizzato per migliorare i vettori AAV per la terapia genica.

Questo metodo può essere facilmente applicato anche ad altre famiglie geniche di rilevanza fondamentale o applicata, come la fluorescenza codificante la dose, tre reporter, enzimi cellulari o proteine coinvolte nell'interferenza dell'RNA. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando stavamo cercando un vettore adatto per trasfondere frammenti di topi adulti con geni terapeutici, rendendoci conto che tutti i sierotipi naturali di AV presentavano svantaggi, come un'elevata diffusione nella popolazione umana e, di conseguenza, una frequenza elevata di immunità preesistente, oppure una scarsa efficacia in vivo nonostante una trasduzione efficiente in coltura. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la frammentazione del gene della capside AV basata sul DNA e alcuni passaggi della produzione della libreria virale sono difficili da apprendere, in quanto richiedono esperienza e consapevolezza delle fasi critiche, al fine di facilitare la preparazione routinaria di quantità sufficienti dei diversi geni della capside virale adeno-associata.

Per la ricombinazione del DNA, questi geni vengono inizialmente sottoclonti in un vettore plasmidico comune. A tal fine, i geni cap desiderati vengono innanzitutto amplificati mediante PCR da plasmidi AAV comunemente disponibili, utilizzando i primer cap F e cap R. I geni cap vengono quindi clonati in un plasmide progettato per contenere specifici siti di legame per primer nonché siti di restrizione. In questo esempio, il gene cap viene clonato nei siti PAC uno e SC uno, presenti nei primer utilizzati per l'amplificazione del cap e nel plasmide ricevente, ma assenti nella maggior parte degli AAV. Dopo aver generato i set di plasmidi che codificano per i geni della capside AAV, si inizia la procedura di ricombinazione del cap mediante PCR, amplificando i geni cap scelti utilizzando i primer T tre e T sette.

Impostare una reazione PCR da 50 microlitri contenente 200 nanogrammi di plasmide cap, ciascun primer a una concentrazione finale di due micromolari, 10 microlitri di buffer five x high five e un microlitro di polimerasi high five. Questa reazione produrrà circa tre microgrammi di prodotto PCR, quantità sufficiente per fino a sei reazioni di shuffling, a seconda del numero di geni cap da includere nella libreria. Iniziare con cinque minuti a 95 gradi Celsius, quindi eseguire 40 cicli di 15 secondi a 94 gradi Celsius, 30 secondi a 57 gradi Celsius e tre minuti a 68 gradi Celsius, seguiti da un passaggio finale di 10 minuti a 72 gradi Celsius.

Dopo aver purificato i prodotti della PCR, si utilizza una digestione controllata del DNA per creare frammenti del gene cap da riunire nuovamente in Kyra. Uno degli aspetti più difficili di questa procedura è ottenere un intervallo utile di frammenti di DNA del gene cap digeriti, da riunire in kyras. A tal fine, si preparano quantità PLE di geni cap purificati da utilizzare come punto di partenza, quindi si impostano diverse reazioni parallele con condizioni variabili. Per impostare la digestione in modo uniforme, mescolare i diversi prodotti della PCR del gene cap fino a un quantitativo totale di quattro microgrammi in 54 microlitri di acqua, quindi aggiungere attentamente sei microlitri di buffer di reazione DS e 0,5 microlitri di DNA uno, agitare delicatamente il tubo per tre volte, centrifugare brevemente ed inserire immediatamente il tubo su un blocco riscaldante a 25 gradi Celsius.

Incubare questa prima reazione per un minuto. Successivamente, preparare una seconda reazione di digestione, ma incubare a 25 gradi Celsius per un minuto e 15 secondi. In questo modo, impostare più reazioni parallele con tempi di incubazione compresi tra uno e due minuti, variando il tempo di incubazione a incrementi di 15 secondi.

Fermare ogni reazione aggiungendo sei microlitri di EDTA 25 millimolare. Vortexare brevemente il tubo e incubare per 10 minuti a 75 gradi Celsius. Le reazioni parallele multiple produrranno cinque campioni di cap digeriti con DNA, uno per tempi di incubazione variabili; purificare i frammenti di cap su un gel standard all'1% AROS.

È preferibile che una striscia sia visibile tra 100 e 500 paia di basi, come mostrato in questo esempio con tempi di incubazione iniziali di un minuto, 45 secondi o due minuti. I frammenti del cap vengono innanzitutto riassemblati in sequenze complete mediante una PCR in cui si autoprimerizzano sulla base di omologie parziali, durante lo shuffling familiare del DNA. Impostare una reazione da 50 microlitri con 500 nanogrammi di frammenti purificati, 10 microlitri di buffer fusione 10x, un microlitro di dNTP 10 millimolare, 1,5 microlitri di DMSO e 0,5 microlitri di fusione.

Due polimerasi incubano per 30 secondi a 98 gradi Celsius, quindi eseguono 40 cicli di 10 secondi a 98 gradi Celsius, 30 secondi a 42 gradi Celsius e 45 secondi a 72 gradi Celsius, seguiti da un passaggio finale di 10 minuti a 72 gradi Celsius. Successivamente, amplificare i geni del cap ricomposti per il successivo clonaggio mediante una seconda PCR utilizzando primer che si legano alle sequenze conservede di estremità. Ad esempio, SAF e SAR o CUF e CUR preparano una reazione da 50 microlitri contenente due microlitri della prima PCR, ciascun primer a una concentrazione finale di due micromoli, 0,5 microlitri di cloruro di magnesio, 10 microlitri di buffer 5x high-FI e un microlitro di polimerasi high-FI.

Si raccomandano da 16 a 24 PCR per garantire rese sufficientemente elevate per il successivo clonaggio. Dopo aver raggruppato le PCR e purificato la banda completa del cap, il passaggio successivo consiste nel digerire il pool purificato del gene cap con PAC I e SC I per il clonaggio in un plasmide AAV competente per la replicazione. Il plasmide ricevente porta le ripetizioni terminali invertite di AAV che delimitano il gene rep di AAV2 sotto il controllo del promotore P5 di AAV, PAC I e ASC I.

I siti di restrizione a valle di rep consentono il clonaggio in frame del pool di cap mescolati. I siti di legame per i primer LSE indicati dalle frecce sono utili per il sequenziamento del gene cap, frammentano i cap e il vettore ricettore tagliato in modo appropriato in un rapporto molare di tre a uno. Preparare una miscela maestra con un volume totale di 40 microlitri, sufficiente per 20 trasformazioni, con una concentrazione finale di DNA di 15 nanogrammi per microlitro.

Incubare tutta la notte a 16 gradi Celsius; il giorno seguente, trasformare la reazione di ligazione in e coli. Mescolare due microlitri di reazione di ligazione con 30 microlitri di e coli elettrocompetente e trasferire in cuvette per elettroporazione precamerate sul ghiaccio; eseguire l'elettroporazione a 1,8 kilovolt, 200 ohm e 25 microfarad. La costante di tempo dovrebbe essere vicina a cinque millisecondi; aggiungere immediatamente un millilitro di mezzo SOC preriscaldato e trasferire in un matraccio da 250 millilitri.

20 di queste elettroporazioni produrranno una libreria con una diversità di circa un milione di cloni diversi. Aggiungere un volume di mezzo SOC preriscaldato alle trasformazioni raggruppate e agitare a 37 gradi Celsius e 180 giri al minuto per un'ora. Successivamente, aggiungere 40 millilitri delle trasformazioni raggruppate a 800 millilitri di mezzo LB contenente ampicillina e incubare per ulteriori 16 ore nelle stesse condizioni; quindi il DNA plasmidico della libreria viene purificato utilizzando un kit disponibile in commercio.

La produzione della libreria virale inizia con la trasfezione di cellule HEC 293T con la libreria AAV. Per iniziare questa procedura, seminare piastre quadrate da 10-15 cm di cellule HEC 293T e coltivarle per 48 ore a 37 gradi Celsius. Per ogni trasfezione, preparare le seguenti due miscele di reagenti in due tubi separati. Le seguenti quantità sono indicate per 10 piastre nel primo tubo.

Mescolare 7,9 millilitri di cloruro di sodio e DNA e aggiungere acqua fino a un volume totale di 15,8 millilitri. Nel secondo tubo, aggiungere 3,52 millilitri di polietileneammina, 7,9 millilitri di cloruro di sodio e 4,38 millilitri di acqua. Combinare le miscele, vortexare e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi distribuire la soluzione uniformemente in ogni piastra di cellule HEK 293T. Incubare a 37 gradi Celsius.

Dopo 48 ore, è possibile raccogliere la libreria virale. Raschiare le cellule nel mezzo, raccogliere le cellule da tutte le piastre in un singolo tubo e centrifugare a 1200 giri al minuto per 15 minuti. Risospendere il pellet cellulare in sei millilitri di tampone di lisi, quindi sottoporre a cinque cicli di congelamento-scongelamento; dopo i cinque cicli, incubare con Ben Nase per un'ora a 37 gradi Celsius.

Successivamente, centrifugare i detriti cellulari a 3.750 giri/min per 20 minuti. Preparare un gradiente per la purificazione del virus utilizzando una pipetta Pasteur per aggiungere cinque millilitri di sospensione virale in un tubo Beckman Quick-Seal per centrifuga, seguiti da 1,5 millilitri ciascuno di soluzione al 15%, 25% e 40% di iodixanolo. Completare il gradiente con tampone lisico e ultracentrifugare a 50.000 K per due ore a quattro gradi Celsius.

Al termine dell'ultracentrifugazione, rimuovere il tubo dal rotore e pulire l'esterno del tubo con etanolo al 70%. Inserire un ago nella parte superiore del tubo per la ventilazione e utilizzare un altro ago per prelevare 1,2 millilitri della frazione IOL al 40%. Prestare attenzione a non prelevare dalla frazione al 25%, poiché contiene particelle vuote.

Capsidi AAV. Singole copie della libreria plasmidica originale vengono analizzate per valutarne la funzionalità e la diversità, utilizzandole per produrre vettori ricombinanti. Vengono quindi infettate cellule o animali coltivati con espressione di un gene reporter mediante diverse quantità di virus purificato e viene determinata l'efficienza di trasduzione.

Qui vengono mostrati i risultati di microscopia a fluorescenza ottenuti da tre linee cellulari umane infettate con cinque diversi vettori ricombinanti che esprimono YFP mediante geni cap riorganizzati. Un metodo alternativo per analizzare l'efficienza di trasduzione è la misurazione basata su fatti dell'espressione del gene reporter fluorescente. Questa figura mostra un risultato tipico ottenuto su quattro tipi cellulari: umano, renale, cervice umana, murino, fibroblasti e linfociti T umani, infettati con 18 diversi vettori ricombinanti che esprimono YFP mediante geni cap riorganizzati, selezionati casualmente da una libreria originale.

L'espressione di YFP è stata codificata con colori per facilitare la visualizzazione. Le percentuali rappresentate si riferiscono alle cellule transdotte, in cui il nero indica lo 0% e il bianco indica il valore più alto misurato in ciascun clone di tipo cellulare. Il clone B due rosso illustra un clone con una scarsa efficacia complessiva, come ci si può aspettare da capside non selezionati. La libreria virale può quindi essere sottoposta a screening per individuare singole particelle che mostrano la maggior parte o tutte le proprietà desiderate in una determinata linea cellulare o in animali, per la selezione.

Nelle cellule coltivate, le cellule vengono innanzitutto co-infettate con diversi aliquote della libreria e del virus ENO a a v per sostenere la crescita di a a v, quindi le cellule vengono raccolte ed il a a v amplificato viene estratto e utilizzato per reinfectare nuove cellule. Determinare i rapporti ottimali tra adenovirus a a v per la co-infezione delle cellule è fondamentale e un buon indicatore di infezione virale efficace è la comparsa di effetti citopatici a tre giorni dall'inoculazione virale, evidenziati dall'arrotondamento e distacco delle cellule. Nel presente schema, il pannello in alto a sinistra mostra cellule non infette, mentre gli altri pannelli mostrano cellule infette con le quantità indicate, espresse in particelle per cellula, di adenovirus. Un altro parametro utile per valutare l'infezione e l'amplificazione di a a v è il rilevamento delle proteine del capside mediante blotting western, utilizzando l'anticorpo B one che riconosce un epitopo altamente conservato del capside di a a v.

La macchia a sinistra mostra cellule co-infette con diversi volumi in microlitri di una libreria a a V e del virus helper ENO vir. Le prime due corsie rappresentano ottimi esempi di condizioni che producono un'espressione della proteina a a v appena rilevabile, indicando un'infezione e un'amplificazione di a a v sufficienti ma non eccessive, e quindi un efficace accoppiamento genotipo-fenotipo. Per questo motivo, 0,11 oppure 10 microlitri di questi sopranatanti sono stati utilizzati per reinfectare cellule fresche.

I risultati del western blot sono mostrati nelle celle a destra. Nelle LA c sono state infettate con un v da solo come controllo negativo. È inoltre fondamentale monitorare la diversità della libreria durante ripetuti cicli di infezione mediante sequenziamento del DNA.

Questo diagramma mostra il confronto tra le sequenze proteiche di cloni di AAV provenienti da una libreria basata sugli AAV 2, 8 e 9, prima e dopo la selezione. Le sequenze al di sopra della linea rossa mostrano gli AAV parentali. Le frecce viola indicano eventi di ricombinazione omologa. La freccia rossa indica un crossing-over tra AAV 2 e AAV 9, osservato in tutti i cloni selezionati. Per la selezione negli animali, la libreria di a a V viene infusa negli animali, recuperata dalle cellule o tessuti bersaglio mediante PCR, quindi riclonata e ripacchettata per un nuovo ciclo di infezione.

Qui viene mostrato un esempio di recupero di cloni di virus a adeno-associati infettivi ottenuti da fegati di topo una settimana dopo l'infusione periferica della libreria. La corsia uno mostra la banda prevista di 2,2 chilobasi, mentre la corsia due è un controllo senza stampo; le dimensioni delle bande del marcatore di DNA nella corsia M sono indicate in chilobasi. Indipendentemente dalla procedura di selezione, le varianti dell'capside arricchite devono infine essere convalidate in sistemi appropriati.

Un esempio delle prestazioni superiori di una kimerina a a V arricchita in cellule coltivate è mostrato qui. Colori più scuri indicano un'infettività maggiore per numero di particelle, e quindi per clone. A-A-V-D-J supera un insieme di otto tipi selvatici naturali a a v in un'ampia gamma di linee cellulari.

Infine, viene mostrata un'analisi di un clone di AAV KYMERA selezionato nel fegato di topo. Un AAV DN è stato selezionato per la sua capacità di trasdurre cellule di epatoma e successivamente utilizzato per produrre vettori ricombinanti esprimenti luciferasi. I topi rappresentativi, tre per gruppo, sono stati analizzati una settimana dopo l'infusione periferica di dosi equimolari di questo vettore o di un controllo basato sull'AAV8 di tipo selvaggio, uno degli isolati naturali più potenti noti per il fegato del topo. Si noti che, sebbene il clone AAV DN produca un'espressione leggermente inferiore nel fegato, esso risulta più specifico per questo organo poiché mostra un notevole riduzione del targeting fuori bersaglio nei tessuti non epatici, una volta corretti i livelli di espressione epatica tramite il software di imaging.

Questa tecnica può essere eseguita in una settimana, a partire dall'amplificazione dei geni della capside a a V e terminando con la libreria virale, se viene effettuata correttamente. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che il protocollo fornito qui deriva dalla nostra esperienza nella selezione di sierotipi naturali di AV e che è molto probabile che alcune condizioni debbano essere adattate e ottimizzate quando altri utenti creano le proprie librerie personalizzate. Oltre a questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la visualizzazione di peptidi mediante mutagenesi sito-diretta con AGENESIS o la randomizzazione basata su PCR, al fine di generare anche librerie altamente diverse o di tentare di migliorare ulteriormente le proprietà delle capside create ed arricchite mediante il DNA family shuffling dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della consegna genica virale per esplorare strategie terapeutiche per malattie e cellule bersaglio correlate, per le quali i tipi convenzionali di A VC avevano fornito risultati insoddisfacenti, come l'infezione da HIV e le cellule T, nonché per esplorare il trasferimento genico mediato da vettori in cellule staminali umane e altre cellule cardiache per infettare cellule in coltura. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ingegnerizzare ed evolvere librerie altamente diversificate di vettori virali adeno-associati sintetici utilizzando una combinazione di frammentazione genica e riassemblaggio, nonché di come selezionare in linea di principio queste librerie in cellule in coltura o in animali al fine di arricchire singoli capside con specifiche proprietà desiderate per l'uso come vettori di trasferimento genico. Non dimenticare che lavorare con adenovirus può essere pericoloso e che molte precauzioni devono essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.