Fruit Analisi Volatile Utilizzando un naso elettronico

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire un'analisi rapida di composti volatili nei frutti. Questo viene ottenuto tagliando e omogeneizzando prima il tessuto del frutto. La fase vapore sopra il campione liquido viene quindi analizzata con il naso elettronico.

Al termine dell'analisi con naso elettronico, i dati vengono esportati e trasformati. L'ultima fase della procedura consiste nell'identificare le finestre dell'indice covas e consolidare i picchi sotto un'unica etichetta di indice covas utilizzando l'interfaccia grafica. In definitiva, i risultati mostrano che le differenze nell'abbondanza dei follicoli fruttici, misurate mediante naso elettronico, possono essere correlate a trattamenti sperimentali come la varietà del frutto, il grado di maturazione e le condizioni di conservazione.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la cromatografia gassosa tradizionale, è che consente un'analisi più rapida dei composti volatili nei frutti. Durante l'esecuzione di questa analisi, possono verificarsi lievi variazioni nei tempi di ritenzione dell'analita. Ciò potrebbe portare a un'errata interpretazione dei dati se non si presta particolare attenzione al processo di allineamento dei picchi.

Dopo aver raccolto i frutti al grado desiderato di maturità, sciacquarli con acqua corrente. Per rimuovere sporco e polvere, selezionare i frutti da analizzare. In base all'assenza di difetti esterni e interni e alla dimensione, tagliare in modo omogeneo i frutti longitudinalmente a spicchi, da utilizzare per il campionamento dei composti volatili.

Se applicabile, rimuovere la buccia, i semi, il tessuto della cavità dei semi o il nocciolo del frutto. La selezione del tessuto deve essere coerente per tutta la durata dell'esperimento, e si deve tenere conto della variabilità all'interno di un singolo frutto. Ad esempio, i campioni devono essere prelevati in ugual misura dalle regioni equatoriali del fiore e dell'estremità peduncolare.

Combinare il tessuto di frutto selezionato, mescolarlo per randomizzarlo e quindi pesarne 200 grammi in un frullatore commerciale. Aggiungere 200 millilitri di soluzione satura di cloruro di calcio. Il cloruro di calcio ha la funzione di inibire l'attività enzimatica, che potrebbe verificarsi dopo il taglio e l'omogeneizzazione della polpa del frutto.

Quindi aggiungere 50 microlitri di una soluzione di 100 millimolare di due metil butil isoato in metanolo. Questa soluzione viene aggiunta come standard interno per monitorare eventuali perdite di composti volatili durante il processo di omogeneizzazione. Successivamente, omogeneizzare la miscela in un frullatore da laboratorio per 30 secondi a 18.000 giri al minuto.

Quindi versare immediatamente in una bottiglia di vetro e sigillare con un coperchio in teflon. Mantenere l'omogenato nella bottiglia fino a quando tutti i campioni sono stati preparati. Pipettare aliquote di cinque millilitri di succo senza schiuma in vial in vetro ambrato da 20 millilitri, preparando almeno tre vial per campione.

Da utilizzare come replicati tecnici. Sigillare i vial con tappi a vite in acciaio dotati di setti in silicone con rivestimento in Teflon. A questo punto, i campioni possono essere analizzati immediatamente oppure congelati rapidamente in azoto liquido e conservati a temperatura ultra bassa per analisi successive.

Caricare il metodo di analisi appropriato sul Xenos. Inserire i parametri indicati nel protocollo scritto. Collegare un ago in acciaio inossidabile con punta non perforante all'ingresso del xenos.

Svuotare il sistema più volte con aria ambiente fino a quando la linea di base è stabile e non vengono rilevati picchi superiori a 200 conteggi. Prepararsi a tarare lo strumento inserendo un ago nel settino di una provetta contenente una soluzione di acidi grassi a catena lineare per smaltire la pressione. Successivamente, inserire l'ago collegato all'ingresso dello strumento nel settino.

Eseguire la taratura avviando il campionamento dello spazio di testa. Il risultato della taratura viene utilizzato dal software dello strumento per convertire il tempo di ritenzione dei picchi indicati da unità di tempo in unità di indice covas o KI. Di conseguenza, dopo che il sistema è stato tarato, i tempi di ritenzione vengono riportati in unità KI.

Avviare l'analisi del campione dopo aver equilibrato il campione per 30 minuti inserendo gli aghi nel settum della provetta del campione. Come eseguito per la soluzione di acidi grassi a catena lineare. Iniziare manualmente il campionamento dello spazio di testa cliccando sul pulsante di riproduzione, attivando così la pompa che aspira i vapori presenti sopra il campione.

Alla fine dell'analisi, un cromatogramma appare sullo schermo e il sensore viene riscaldato automaticamente a 150 gradi Celsius per 10 secondi per essere pulito. Quando la casella di stato del sistema torna verde, lo strumento è nuovamente pronto per analizzare un altro campione. Per garantire una linea di base stabile e una corretta pulizia del sistema, eseguire almeno un bianco d'aria tra un campione e l'altro.

Analizzare almeno tre replicati tecnici per campione, oltre ai bianchi del vial. Esportare i dati in un file Microsoft Excel dopo l'acquisizione, utilizzando la funzione di archiviazione dati di registro nel software Mense. Una volta esportati i dati, aggiungere colonne contenenti etichette per le variabili e i replicati.

Il formato dei dati esportato dal software dello strumento può essere trasformato per una più facile manipolazione utilizzando lo script Python 0.6 generato da questo laboratorio. Il nome del file sorgente e il nome del foglio per i dati di ingresso, così come il nome desiderato per il file di uscita, vengono modificati direttamente nello script. Questo script facilita la manipolazione e l'analisi dei dati mediante l'identificazione di kis unici in tutti i campioni.

I dati vengono riordinati con le informazioni sui campioni disposte in righe e i KIS unici in colonne, dove ogni cella rappresenta l'area del picco corrispondente. Se un picco non viene rilevato per un valore KI in un campione, la cella corrispondente rimane vuota. Successivamente, utilizzando un secondo script generato da questa importazione in laboratorio, i dati vengono importati dal file modificato nel passaggio precedente.

L'analisi si basa sull'osservazione e sulla valutazione del numero di volte in cui ciascun valore di KI è stato rilevato. Pertanto, il programma visualizza un istogramma dei riscontri di KI. Per ogni valore di KI, valutare i riscontri di K relativi a specifici sottogruppi di campioni, analizzando ogni gruppo di replicati tecnici insieme.

A tale scopo, analizzare ogni trattamento o variabile separatamente selezionando o deselezionando le caselle corrispondenti. Dopo aver identificato la larghezza di ciascuna finestra KI mediante l'interfaccia grafica, selezionare casualmente alcuni dei cromatogrammi corrispondenti. Nel software mense, valutare i picchi sovrapposti tra i replicati tecnici.

Una volta individuata la finestra KI, si utilizza la funzione di unione nell'interfaccia grafica per fondere i KIS che cadono nella finestra nel ki più popolato, in primo luogo. Fare clic sul pulsante di unione per attivare la funzione e selezionare il ki più popolato al centro della finestra cliccando con il tasto sinistro sulla barra corrispondente. Una volta selezionata la barra, essa cambia colore e diventa verde; per unire i KIS che rientrano nella finestra al ki selezionato, fare clic con il tasto destro sulle barre corrispondenti.

Questo fa diventare le barre rosse mentre una barra blu della lunghezza corrispondente viene aggiunta sopra il ki centrale. Una volta che tutti i ki selezionati sono stati uniti nel ki centrale appropriato, fare clic nuovamente sul pulsante di unione per confermare le modifiche. In caso di errori, ciò fa diventare giallo il pulsante di unione.

Il pulsante di annullamento unione è disponibile anche per annullare l'unione. Fare clic sul pulsante di annullamento unione nell'interfaccia grafica. Quindi fare clic con il tasto destro sulla barra rossa da cui annullare l'unione.

Dal rosso, la barra diventa blu. Fare clic nuovamente sul pulsante annulla unione per accettare le modifiche. Se si tenta di unire in modo errato due picchi in un singolo campione in un unico valore KI, viene visualizzato un messaggio di errore.

Dopo aver salvato tutte le operazioni di unione, salvare il file prima di procedere con l'analisi statistica; i cromatogrammi dei bianchi d'aria e dei bianchi del vial vengono analizzati per monitorare eventuali contaminazioni. Una volta identificati i picchi e i bianchi, sottrarre l'area del picco rilevato nel bianco d'aria e/o nel bianco del vial dall'area del picco presente nel campione. Il naso elettronico è stato in grado di rilevare differenze nei profili volatili tra frutti di melone raccolti a diversi stadi di maturità.

Qui vengono mostrati esempi di cromatogrammi di frutti a maturità iniziale e frutti completamente maturi, che rivelano le differenze nell'area dei picchi. Per numerosi picchi, sono state identificate finestre di 20 K in tutti i campioni. Un'analisi delle varianti ha mostrato che, tra questi diversi kis, l'abbondanza di 14 picchi rilevati dal naso elettronico variava significativamente tra le due fasi di maturità. In questo caso, l'abbondanza dei picchi dei frutti a maturità iniziale per ciascuno di questi kis è riportata in verde, mentre quella dei frutti completamente maturi è riportata in arancione.

Dopo aver completato questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la cromatografia gassosa abbinata alla spettrometria di massa al fine di identificare i componenti corrispondenti ai singoli picchi del naso elettronico dopo il suo sviluppo. Questa tecnica fornirà uno strumento di analisi rapida e consentirà ai ricercatori nel campo della patologia vegetale, della fisiologia vegetale, della biologia post-raccolta e delle scienze alimentari di esplorare le variazioni nella composizione di composti volatili nei frutti in funzione della maturità, della varietà o della conservazione. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come analizzare rapidamente i composti volatili con un naso elettronico ed eseguire l'allineamento dei picchi utilizzando la nostra interfaccia grafica.