Microscopia Multiphoton di cervello di topo Cancellato Esprimere YFP

La microscopia multifotonica su tessuti fissati è normalmente limitata a profondità di penetrazione ridotte, di appena poche centinaia di micron. Abbiamo recentemente dimostrato il primo utilizzo della microscopia multifotonica fino a diversi millimetri all'interno di organi fissati di topo, mediante chiarificazione ottica con una soluzione di alcol benzoico e benzoato di benzile. Nella nostra dimostrazione iniziale, la tecnica ha rilevato la fluorescenza intrinseca del tessuto.

Tuttavia, cresce l'interesse nell'utilizzo di metodi di chiarificazione ottica su tessuti che esprimono proteine fluorescenti come la GFP. Presentiamo qui un protocollo per la microscopia a fotoni multipli di tessuto cerebrale chiarificato, utilizzando la stessa soluzione di alcol benzoilico che preserva la fluorescenza della proteina fluorescente gialla espressa da un promotore nel cervello del mouse. L'imaging ad alta risoluzione di interi organi di topo mediante microscopia a fotoni multipli diventa possibile grazie alla chiarificazione ottica dell'organo prima dell'acquisizione delle immagini, senza compromettere la qualità ottica.

L'acquisizione di immagini del cervello è limitata a 300 micron sotto la superficie del tessuto a causa degli effetti di scattering della luce causati dalle differenze tra gli indici di rifrazione dell'acqua e delle proteine che compongono il tessuto cerebrale. Per superare questo limite, l'organo viene disidratato e l'acqua viene sostituita con un fluido che ha un indice di rifrazione simile a quello delle proteine costitutive del tessuto. Questo processo di chiarificazione ottica contribuisce a ridurre notevolmente lo scattering della luce, consentendo un'acquisizione di immagini migliore a maggiori profondità sotto la superficie del tessuto.

Le immagini di Batta et al. dimostrano come questa tecnica possa essere applicata per visualizzare l'istologia di diversi organi del topo mediante fluorescenza intrinseca e generazione di armonica secondaria. Questa prima immagine mostra il testicolo del topo, acquisita a 1,4 millimetri sotto la superficie del tessuto. L'elevata risoluzione propria della microscopia a fotoni multipli ci consente di effettuare uno zoom e osservare chiaramente le singole cellule spermatiche in formazione all'interno dei tubuli seminiferi.

Come si vede all'estrema destra, mostriamo un'immagine del polmone del topo, acquisita anche essa a 1,4 millimetri sotto la superficie del tessuto. Questa immagine dimostra un'acquisizione multiphoton a due canali in cui i componenti dell'elastina sono marcati in rosso mentre il collagene è marcato in verde; ingrandendo, singoli oli sono facilmente distinguibili. Infine, mostriamo immagini ad alta risoluzione delle regioni interne del cervello del topo, acquisite a 850 micron sotto la superficie del tessuto. Ingrandendo la neocorteccia e l'ippocampo del cervello, singoli astrociti e corpi cellulari dei neuroni possono essere chiaramente visibili.

Tuttavia, quando si trattano organi resi otticamente trasparenti che possono contenere proteine fluorescenti come la YFP, il protocollo di chiarificazione ottica di Badra non preserva affatto il segnale fluorescente di queste proteine. Il protocollo qui presentato rappresenta un nuovo approccio per eseguire la chiarificazione ottica e l'imaging completo di organi interi nel topo, mantenendo al contempo il segnale fluorescente della YFP e dei neuroni, disidratando il cervello mediante una serie graduata di etanolo e procedendo alla chiarificazione con una soluzione uno a due di alcol benzoilico e benzoato, noto anche come BAB, che si è dimostrata efficace nel ridurre i danni alle proteine fluorescenti e nel preservarne il segnale. Per l'imaging a fotoni multipli, i topi esprimenti YFP vengono innanzitutto pesati e quindi anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di ketamina e xilazina.

Deve essere confermata una corretta profondità di anestesia prima di procedere con l'intervento chirurgico. L'animale deve essere controllato ogni cinque minuti per verificare se reagisce a una pinzatura decisa dell'alluce o della coda. Se l'animale reagisce, è necessaria una dose supplementare di chetamina e xilazina.

Dopo l'anestesia, i topi vengono mantenuti in posizione fissando ogni arto a un lettino chirurgico mediante nastro adesivo da laboratorio, in modo che il topo si trovi in posizione supina con il torace esposto per l'intervento. Per iniziare, si effettua un'incisione al di sotto del processo xifode per praticare un taglio lungo la base della gabbia toracica, utilizzando forbici e pinzette per tirare indietro la pelle durante il taglio; successivamente vengono effettuate due incisioni lungo i lati dello sterno del topo, creando una linguetta di tessuto che viene tenuta sollevata dalla cavità toracica mediante un emostatico, in modo da esporre il cuore. Successivamente, un ago da 23 gauge viene inserito nel ventricolo sinistro del cuore e viene praticata una piccola incisione nella parete muscolare dell'atrio destro per permettere al sangue di fuoriuscire. Immediatamente dopo aver inciso l'atrio destro, si inizia una perfusione con soluzione salina equilibrata al fosfato a quattro gradi Celsius finché non esce più sangue dall'atrio destro.

Durante la perfusione, si utilizza una pompa peristaltica regolata in modo da espellere il liquido a una distanza di 1,5-5 cm dalla punta dell'ago. Una volta drenato completamente il sangue, il mezzo di perfusione viene sostituito con una soluzione di paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius, fino a quando il corpo del topo diventa visibilmente rigido e rigido. Al termine della perfusione, il topo viene rimosso dal lettino chirurgico e decapitato per iniziare l'escissione del cervello mediante pinze e forbici per iridectomia.

Il cranio viene rimosso in piccole sezioni partendo dalla parte posteriore e procedendo verso l’avanti. Vengono effettuati piccoli tagli ogni due-quattro millimetri con le forbici lungo il cranio, mentre con la pinza si estrae con attenzione l’osso dal cervello a piccole sezioni, fino a quando l’intera superficie superiore del cervello viene esposta. Il cervello viene quindi escisso dal cranio utilizzando una spatola chirurgica e trasferito in un’apposita provetta di vetro contenente paraformaldeide al 4% per la fissazione, che dura sei ore.

Sebbene per questa dimostrazione ci stiamo concentrando principalmente sull'immagine del cervello di topo che esprime YFP, procederemo anche con la chiarificazione ottica di un topo, di una zampa posteriore e di un tratto di intestino tenue, per mostrare al meglio le capacità di chiarificazione di questo metodo. Dopo la fissazione post-operatoria, il cervello e gli altri tessuti vengono lavati due volte in PBS. I campioni di tessuto vengono quindi disidratati a temperatura ambiente mediante una serie di incubazioni in etanolo alle concentrazioni del 50%, 70%, 90% e 100%.

Ogni incubazione dura due ore, seguita da una seconda. Un'incubazione con etanolo al 100% per 12 ore viene eseguita per estrarre in modo efficiente l'acqua dal tessuto fissato. Dopo la disidratazione, la soluzione finale di etanolo al 100% viene rimossa e i campioni di tessuto vengono immersi in una soluzione uno a uno di etanolo e BAB per due ore, prima di essere trasferiti nella soluzione chiara al 100% di BAB.

Dopo essere stati immersi nel BAB, i campioni cerebrali e di altri tessuti diventano visibilmente trasparenti entro quattro o cinque ore. Di seguito mostriamo un video in time-lapse delle prime sei ore del processo di chiarificazione ottica. Il segno di salto indica il momento in cui la soluzione uno a uno di etanolo e BAB è stata sostituita con una soluzione al 100% di BAB.

Dopo sei ore, tutti gli organi mostrano segni di trasparenza; ad esempio, l'osso della zampa posteriore del topo è ora chiaramente visibile per ottenere i migliori risultati di chiarificazione. Il cervello deve essere lasciato in chiarificazione per sei giorni a temperatura ambiente, protetto dalla luce intensa. Una volta che il cervello è stato chiarificato e risulta pronto per l'acquisizione di immagini, viene fissato al fondo della vostra piastra di Petri utilizzando acrilico Sano o colla istantanea.

Dopo l'essiccazione della colla, il cervello viene immerso nel BAB e la piastra di Petri viene posizionata sotto l'obiettivo per l'acquisizione delle immagini. Per l'acquisizione, utilizziamo un microscopio a fotoni multipli che incorpora un laser al titanio-saffio MI tie regolabile tra una lunghezza d'onda di eccitazione di 710 e 990 nanometri. La lunghezza d'onda di eccitazione utilizzata per generare i segnali YFP è di 886 nanometri.

Il segnale fluorescente riflesso viene quindi acquisito utilizzando un obiettivo NIK icon da 5x che consente l'acquisizione con un ampio campo visivo. Il segnale fluorescente riflesso viene filtrato mediante un filtro passa-banda 535/50 e raccolto utilizzando un fotomoltiplicatore ad alta efficienza quantistica. Le immagini da Multiplier due di OMA Matsu vengono elaborate mediante il software Scan Image a una risoluzione di 2048 per 2048 pixel, utilizzando una velocità di scansione di due millisecondi per riga, al fine di generare immagini ad alta risoluzione di YFP.

Al termine dell'acquisizione delle immagini, il cervello viene rimosso dalla piastra P due e conservato in BAB, protetto dalla luce, per future acquisizioni. Le immagini e i video rappresentativi mostrati qui dimostrano la capacità di imaging multiphoton ad alta risoluzione resa possibile dalla chiarificazione ottica. L'imaging dell'intero cervello permette di visualizzare chiaramente i neuroni marcati con YFP nei diversi strati dell'ippocampo e della neocorteccia fino a una profondità di due millimetri sotto la superficie del tessuto.

Qui mostriamo un video di uno stack di immagini di 1,2 millimetri dell'intera bocca, acquisito da 0,8 a due millimetri all'interno del cervello per rivelare i diversi strati anatomici dell'ippocampo. Di seguito è riportata un'immagine rappresentativa di una sezione coronale a 1,94 millimetri, denominata a Bergman, ottenuta dallo stack di immagini profondo due millimetri, in cui i diversi strati dell'ippocampo sono stati etichettati. Eseguendo uno zoom sulla neocorteccia, le singole assoni e i corpi cellulari neuronali dei neuroni peral dello strato cinque della neocorteccia sono chiaramente distinguibili fino a 1,02 millimetri sotto la superficie del tessuto.

Qui mostriamo una serie di immagini di neuroni del quinto strato acquisite tra 700 e 1020 micron sotto la superficie del tessuto. Di seguito è riportata un'immagine rappresentativa di tale serie, acquisita a 774 micron di profondità nel cervello. Utilizzando la stessa serie di immagini, è stata realizzata una ricostruzione tridimensionale della regione neuronale mediante il software Image J.

La capacità di risoluzione elevata della microscopia multi bot ci permette anche di presentare immagini di singoli neuroni completi. Qui mostriamo una ricostruzione di un neurone del quinto strato della neocorteccia in cui i processi dendritici sono chiaramente visibili. Questo conclude la nostra presentazione della schiaritura ottica, del cervello intero del topo che esprime YFP.

La realizzazione di questa tecnica è relativamente semplice e, come abbiamo mostrato, può essere utilizzata per visualizzare e acquisire immagini di molte diverse regioni e strutture del distretto del topo. Grazie per aver guardato e buona fortuna.