Analizzando internalizzazione cellulare di nanoparticelle e batteri da Multi-spettrale Citometria a Flusso Imaging

Per analizzare i meccanismi cellulari di internalizzazione di nanoparticelle e batteri mediante citometria a flusso con imaging multispettrale. I macrofagi vengono innanzitutto pretrattati con citocalasina D per inibire la polimerizzazione dell'actina. Vengono quindi aggiunte nanoparticelle o salmonella al monostrato di macrofagi e incubate.

Successivamente i macrofagi vengono raccolti, fissati e marcati per l'analisi mediante un sistema di imaging in flusso. Le cellule analizzate con citometria a flusso multispettrale che hanno internalizzato nanoparticelle e/o salmonella vengono distinte da quelle con nanoparticelle e/o salmonella legate alla superficie. I dati ottenuti indicano che sia salmonella che nanoparticelle vengono internalizzate soltanto da cellule che non sono state trattate con citocalasina.

D, suggerendo che l'internalizzazione dipende dall'actina. Questa tecnica presenta diversi vantaggi rispetto ai metodi esistenti, come la citometria a flusso e la microscopia confocale. Principalmente, fornisce una misura accurata delle intensità del segnale fluorescente e della risoluzione spaziale tra diverse caratteristiche cellulari ad alta velocità.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali sia per la ricerca sui vaccini e sul rilascio di farmaci con biomateriali, sia per lo studio delle interazioni tra patogeni e ospite. Ciò comprende la definizione delle vie di internalizzazione utilizzate dai nanoparticelle di polianidride e dai batteri. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo spesso incontrano difficoltà.

È importante dedicare del tempo alla titolazione dei coloranti per ottenere segnali di fluorescenza ottimali. Inoltre, è necessario prendere familiarità con il software e creare modelli di analisi, il che richiede tempo. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo scoperto che le nanoparticelle polimeriche idrofile mostrano caratteristiche simili a quelle dei patogeni durante l'impiego della microscopia e di altre tecniche.

Successivamente, desideravamo un sistema ad alto rendimento per confrontare i processi di internalizzazione utilizzati da Salmonella e dalle nanoparticelle di idruro di polline, prima di eseguire il saggio. Tutte le colture cellulari batteriche e mammaliane devono essere raccolte e le sospensioni di nanoparticelle devono essere preparate. Iniziare raccogliendo le cellule RA W2 64.7 confluenti utilizzando un raschietto cellulare.

Determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro. Quindi seminare le cellule in una piastra da coltura a 24 pozzetti a una densità di cinque per 10 alla quinta cellule per pozzetto in 0,5 millilitri. Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore con 5% CO2 con DMEM completo.

Per preparare il taricato di salmonella, diluire la salmonella in C-D-M-E-M per ottenere una molteplicità di infezione di cento per cellule RAW 264,7 in un tubo di vetro autoclavabile con tappo a vite da 16 per 125 millimetri. Successivamente, utilizzando carta da filtro sterilizzata, pesare cinque milligrammi di nanoparticelle cariche al 1% di FITC in anidride polimerica, prodotte come descritto dai colleghi Rean nella loro pubblicazione del 2009 su Pharmaceutical Research, in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere le nanoparticelle a 0,5 millilitri di soluzione salina tamponata al fosfato fredda e porre il tutto sul ghiaccio.

Mantenere il tubo in ghiaccio. Utilizzare un processore ultrasonico per liquidi con una micropunta per sottoporre a sonica la sospensione per circa 25 secondi a quattro-sei joule. Ora che tutte le cellule e i reagenti necessari sono pronti, è possibile eseguire il saggio di fagocitosi.

Etichettare le piastre per colture cellulari a 24 pozzetti contenenti cellule RAW264.7 coltivate, in preparazione al saggio sulla prima piastra. Ciascuno dei seguenti campioni sarà sottoposto a saggio in triplicato: citocalasina D con nanoparticelle, citocalasina D con Salmonella, mezzo con nanoparticelle, mezzo con nanoparticelle di Salmonella, solo Salmonella e cellule colorate con AF647 come controlli a quattro gradi Celsius. Questi ultimi saranno analizzati sulla seconda piastra e includeranno incubazione di mezzo più nanoparticelle e mezzo più Salmonella a questa bassa temperatura, per rallentare i processi cellulari come la fagocitosi. Un'ora prima dell'induzione, aggiungere cinque microgrammi per millilitro di citocalasina D e di C-D-M-E-M ai pozzetti appropriati e incubare le cellule a 37 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, vortexare la sospensione di nanoparticelle e aggiungere 10 microlitri nei pozzetti appropriati. Quindi vortexare il salmone e aggiungerlo nei pozzetti appropriati a un MOI di 100. Agitare leggermente la piastra alcune volte per mescolare.

Quindi posizionare le piastre con i campioni a 37 gradi Celsius e le piastre di controllo negativo a quattro gradi Celsius per 45 minuti. Dopo l'incubazione, mettere le piastre sul ghiaccio e lavare le cellule due volte con PBS freddo senza calcio e magnesio, aspirando e scartando il vecchio mezzo per rimuovere le particelle non legate, il *Salmonella* e le cellule morte o staccate. Utilizzare petalo magnesio.

La prelavaggio con PBS a questo stadio è essenziale perché facilita il distacco delle cellule dal substrato. Per raccogliere le cellule, aggiungere 250 microlitri di PBS freddo su ghiaccio e staccare delicatamente le cellule dalle pareti dei pozzetti; trasferire quindi le cellule raccolte in provette microcentrifuga con tappo a scatto silanizzate e mantenerle sul ghiaccio. Lavare le cellule aggiungendo un millilitro di buffer freddo di lavaggio, quindi centrifugare a 250 × g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver eliminato il soprannatante, rimuovere il buffer residuo tamponando la provetta microcentrifuga capovolta sulla carta assorbente.

Ri-sospendere il pellet cellulare muovendo delicatamente il microcentrifugetto attraverso un portaprovette. Per fissare le cellule, aggiungere 100 microlitri di paraformaldeide al 4% in PBS e lasciare riposare le cellule per 15 minuti. A temperatura ambiente, lavare le cellule aggiungendo un millilitro di buffer perm wash, quindi centrifugare a 250 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo aver scartato il soprannatante, rimuovere il tampone residuo come in precedenza. Quindi procedere alla colorazione delle cellule RA W2 64.7. Per l'actina, aggiungere 100 microlitri di tampone perm wash contenente Alexa Fluora foid in sei 60 per 15 minuti.

A temperatura ambiente, i campioni non colorati devono essere incubati con il buffer di permeabilizzazione e lavaggio senza phin. Dopo la colorazione, lavare e centrifugare nuovamente le cellule, quindi risospendere in 50 microlitri di PBS contenente 1%PFA e conservare al buio a quattro gradi Celsius fino all'acquisizione. Accendere, avviare l'analisi delle immagini ed eseguire.

Isprima e inizializza la fluidica nel menu file. Seleziona carica modello predefinito. Nella galleria delle immagini, nel menu visualizza, seleziona tutto e premi esegui configurazione per iniziare l'acquisizione delle perline; se necessario, regola il tracciamento del core per centrare le immagini lateralmente.

Selezionare il canale in campo chiaro e fare clic su "imposta intensità". Attendere finché il coefficiente di variazione della velocità di flusso non sia costantemente inferiore allo 0,2%. Nella scheda assist, fare clic su "avvia tutto" per eseguire calibrazioni e test e verificare che tutti siano stati superati nel software. Fare clic su "carica campione".

Quindi, quando indicato, posizionare il vial contenente il campione più luminoso. Con tutti i fluorocromi nel caricatore di campioni, selezionare l'ingrandimento 40 x. Una volta stabiliti i parametri dello strumento, non modificarli per tutta la durata dell'esperimento.

Accendere ciascun laser dell'esperimento facendo clic sui relativi icone nel software e regolare la potenza del laser in modo che ogni fluorocromo presenti valori massimi di pixel compresi tra 104.000 conteggi, come misurato nei grafici a dispersione. Per eliminare la raccolta di oggetti indesiderati, fare clic sulla finestra del classificatore cellulare nel software. Quindi, per raccogliere esclusivamente dati cellulari, selezionare il canale del limite inferiore dell'area per il campo chiaro e impostare il valore a 50 micrometri: gli oggetti con area inferiore a 50 micrometri saranno considerati detriti e non verranno acquisiti.

Selezionare i canali da acquisire facendo clic sui corrispondenti icone dei canali nel software qui. I canali 1, 2, 3, 4, 5 e sei sono selezionati nella scheda di configurazione. Inserire il numero del file e la cartella di destinazione.

Impostare il numero di sequenza su uno e il numero di eventi da acquisire su 5 000. Fare clic su esegui, acquisisci per raccogliere e salvare il file di dati del primo esperimento. Fare clic su FLL ed eseguire il campione sperimentale successivo.

Ripetere fino a quando tutti i campioni sperimentali non sono stati raccolti. Successivamente, per eseguire i controlli, fare clic su comp settings. Questo disabiliterà il campo chiaro e il laser di scattering e permetterà la raccolta di tutti i canali di fluorescenza nella scheda acquire.

Modificare il valore di input a 500. Quindi posizionare il tubo di controllo e fare clic su esegui. Acquisire per raccogliere 500 cellule positive nei controlli colorati singolarmente.

Ripetere per ogni fluorocromo presente nell'esperimento al fine di sviluppare una matrice di compensazione. Una volta acquisite tutte le immagini campione, avviare il software di analisi ideas su un computer dedicato all'analisi facendo doppio clic sull'icona ideas presente sul desktop. Fare doppio clic sull'internalization wizard e caricare uno dei file RIF del campione di prova.

Una finestra popup fornirà le istruzioni per caricare i file di prova. Seguire le istruzioni e fare clic sul pulsante successivo. Successivamente, fare clic su nuova matrice.

Questo avvierà la procedura guidata per la compensazione. Quando richiesto, selezionare i file di dati per i controlli monocromatici per aggiungerli. Fare clic su "Avanti" nella procedura guidata seguendo le istruzioni, fino a quando il file della matrice di compensazione viene salvato e caricato nella casella al passo due della procedura guidata di internalizzazione.

Fare clic su Avanti e seguire le istruzioni fino a quando non viene generato un file DAF. Impostare le proprietà di visualizzazione dell'immagine selezionando i canali utilizzati durante l'acquisizione. Fare clic sul canale due per FITC e sul canale cinque per AF60.

Brightfield e scatter laterale sono selezionati per impostazione predefinita. Selezionare il canale Brightfield O per delineare il contorno cellulare e il canale O2 in cui sono stati raccolti i nanoparticelle o i batteri per la sonda di internalizzazione, al fine di definire la popolazione di singole cellule; viene quindi generato un grafico a dispersione dell'area in brightfield rispetto al rapporto di aspetto in brightfield di tutte le cellule. L'analisi ad alto rendimento di più file di dati richiede un file modello, pertanto è di fondamentale importanza definire con attenzione le porte durante la creazione del file modello.

Ogni punto rappresenta i valori di un'immagine singola di cellula. Fare clic su un singolo punto in un grafico per selezionare l'immagine di quella particolare cellula nella galleria di immagini.

Successivamente, tracciare un'area di selezione intorno alle cellule con un'area e un rapporto di aspetto corrispondenti a eventi di singola cellula. Le cellule singole presentano un rapporto di aspetto pari a circa uno, mentre le coppie di cellule (doublets) hanno un rapporto di aspetto di circa 0,5.

Fare clic su più cellule per distinguere la regione contenente cellule singole da doppietti o detriti. Per generare un istogramma della radice quadrata media del gradiente dell'immagine in campo chiaro. Fare clic sul pulsante successivo.

Quindi, nella scheda popolazione, selezionare l'opzione bin per visualizzare il bin selezionato. Fare clic sui bin per determinare la posizione delle cellule e il miglior fuoco. Iniziare e tracciare una regione lineare per guidare le cellule a fuoco.

Più alto è il valore RMS del gradiente, meglio è la messa a fuoco; in tal caso, saltare il passaggio successivo, a meno che non vi siano altri marcatori su cui effettuare la selezione. Viene generato un nuovo grafico a dispersione che riporta sull'asse X l'intensità del canale due e sulle asse Y il valore massimo del pixel del canale due. Fare clic sui punti e visualizzare le immagini per identificare la regione da tracciare attorno alle cellule positive a nanoparticelle o batteri.

Viene generato un istogramma della caratteristica di internalizzazione con una regione che inizia da zero, che deve essere regolata osservando le immagini. La caratteristica di internalizzazione è il rapporto tra l'intensità all'interno della cellula e l'intensità dell'intera cellula. È scalata in modo tale che a un valore di zero metà dell'intensità si trovi all'interno.

Il programma ha creato una regione di ciascuna cellula che delimita l'interno, generando una maschera utilizzata come input nell'immagine della cellula per individuare la superficie cellulare, quindi erodendo tale maschera di quattro pixel. Si noti che questa maschera può essere regolata manualmente per diversi tipi cellulari, qualora necessario, creando innanzitutto una maschera oggetto sull'immagine in campo chiaro ed erodendo poi questa maschera di un numero maggiore o minore di pixel. La caratteristica di internalizzazione viene calcolata sulla base di questa maschera oggetto erosa, mediante un algoritmo presente nel software.

Questa funzione ci permette di distinguere le particelle e i batteri internalizzati, che presentano la maggior parte del segnale fluorescente all'interno del limite della maschera, dalle particelle e dai batteri legati alla superficie, il cui segnale fluorescente è prevalentemente esterno al limite della maschera, come mostrato in questo esempio. Creare un nuovo istogramma con una nuova caratteristica di internalizzazione basata sulla maschera dell'oggetto erosa. Tracciare una regione per impostare una finestra (gate) sulle cellule internalizzate visualizzando le immagini in modalità bin selezionato. Impostare la finestra a 0,3. Qui.

Le cellule con un punteggio inferiore a 0,3 sono considerate cellule positive per particelle legate alla superficie. Per eliminare le cellule con marcatura di fondo e identificare nanoparticelle o batteri specificamente internalizzati, selezionare caratteristiche dal menu di analisi. Fare clic sul menu di analisi.

Quindi fare clic sulla funzione di conteggio delle macchie accanto per aggiungere il conteggio medio delle macchie al rapporto statistico. Nel menu dei rapporti, fare clic sull'icona dei rapporti. Quindi definire il rapporto statistico, quindi aggiungere colonne, quindi selezionare la popolazione cellulare appropriata.

Fare clic su OK. La procedura guidata di internalizzazione aggiungerà automaticamente le statistiche a questo rapporto per salvare il file di dati come file modello da utilizzare per l'analisi in blocco di tutti i file sperimentali. Fare clic sul menu file e selezionare Salva come modello.

File modello. Hanno l'estensione dot AST per analizzare più file di dati nel software IDEA. Fare clic su Strumenti e selezionare file di dati in blocco e inserire tutti i file RIF.

Aggiungere il file della matrice di compensazione e il file modello nelle sezioni corrispondenti per inviare il batch all'elaborazione, quindi fare clic su Invia. Dopo il passaggio di elaborazione, tutti i file RAF vengono analizzati e vengono generati file DAF per ciascuno dei file grezzi individuali. Viene prodotto un rapporto finale con statistiche per tutti i campioni, al fine di confrontare l'effetto dell'inibizione dell'actina e della bassa temperatura sulla fagocitosi di salmonella e nanoparticelle.

Le cellule RA W2 64.7 sono state incubate a 37 gradi Celsius in mezzo, sia in presenza che in assenza di citocalasina D oppure in mezzo a quattro gradi Celsius. Sia la temperatura che le manipolazioni dell'actina hanno ridotto l'internalizzazione sia delle nanoparticelle che del salmonella. Tuttavia, l'incubazione delle cellule in citocalasina D ha aumentato la percentuale di cellule con nanoparticelle legate alla superficie, riducendo al contempo la percentuale di cellule con salmonella legato alla superficie.

La percentuale di cellule positive per nanoparticelle legate alla superficie aumenta da circa l'8% a 37 gradi Celsius a oltre il 35% dopo il trattamento con citoscalina D o a quattro gradi Celsius. Al contrario, la percentuale di cellule con Salmonella legata alla superficie è ridotta dal 35% al 15% dopo il trattamento con citoscalina D. L'incubazione delle cellule RAW 264.7 con Salmonella a quattro gradi Celsius riduce l'internalizzazione senza un evidente aumento della quantità di batteri legati alla superficie rispetto al controllo a 37 gradi Celsius. Nel complesso, questi dati dimostrano che Salmonella e le nanoparticelle vengono internalizzate attraverso un processo cellulare simile, che richiede l'actina ed è dipendente dalla temperatura.

Inoltre, i dati indicano che l'adesione prolungata di salmonella ai macrofagi richiede la polimerizzazione dell'actina. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come esaminare l'internalizzazione cellulare di nanoparticelle e batteri mediante citometria a flusso con imaging multispettrale. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che gli inibitori sono citotossici.

Pertanto, sono necessari esperimenti preliminari di profilazione della citotossicità per determinare le concentrazioni ottimali da utilizzare. Non dimenticare che lavorare con salmonella può essere pericoloso; precauzioni, come indossare l'adeguata attrezzatura di protezione individuale ed evitare la formazione di aerosol, devono essere osservate durante l'esecuzione di questa procedura.