Do-It-Yourself dispositivo per il recupero di campioni crioconservati cadere accidentalmente nelle cisterne criogeniche

L'obiettivo di questa procedura è facilitare il recupero di campioni da box criogenici e da provette criogeniche contenute in taniche doppie riempite con azoto liquido, utilizzando un dispositivo di facile costruzione. Questo risultato si ottiene innanzitutto rimuovendo uno o due supporti del congelatore per creare spazio necessario alle manovre ed inserire il dispositivo verticalmente nella tanica. Il secondo passaggio consiste nel raschiare delicatamente il fondo della tanica con il dispositivo.

Successivamente, sollevare verticalmente il dispositivo lungo le pareti del contenitore per recuperare la scatola congelatore dal serbatoio; l'ultimo passaggio consiste nell'afferrare la scatola recuperata dal fondo del contenitore e reinserire gli scaffali congelatore rimossi. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il travaso o l'utilizzo di barre piene di azoto liquido, è che offre un'alternativa semplice, sicura e rapida, che preserva l'integrità del campione ed è eseguibile da un singolo operatore. Per iniziare l'assemblaggio del dispositivo criotollerante, utilizzare una pinza per raddrizzare un lato di un fermo triangolare resistente, ottenendo così un fermo resistente a forma di L.

Come mostrato qui, le dimensioni del tirante resistente possono essere scelte in base al diametro del collo del dispositivo. Devono essere realizzati due di questi tiranti resistenti per permettere al dispositivo di recuperare scatole criogeniche di cinque pollici e mezzo per cinque pollici e mezzo. Fissarli con un tirante resistente TST utilizzando un bullone a corona, un dado, una rondella e una vite per formare la base della paletta criogenica.

Il dispositivo dovrebbe ora apparire come mostrato qui. Utilizzando ora una piastra scanalata, allineare le scanalature del tirante a T resistente con le scanalature su una delle estremità della piastra scanalata. Quindi fissare i due componenti insieme con dadi e bulloni Hillman.

Praticare fori per il fissaggio se la piastra scanalata e i tiranti non presentano fori preforati. Se desiderato, è possibile formare un manico piegando l'altra estremità della piastra scanalata e avvolgendola con schiuma. Per afferrare meglio il dispositivo, assicurarsi di rimuovere la schiuma prima dell'immersione in acqua.

Il dispositivo fai-da-te per il recupero tollerante al freddo estremo può essere adattato anche per il recupero di provette criogeniche. Questo implica la sostituzione della base piatta con un colino in acciaio inox modificato per raccogliere le provette dal liquido. Per iniziare il montaggio, svitare innanzitutto i dadi e i bulloni della corona, quindi fissare la robusta cinghia a T alla piastra scanalata.

Quindi, prima di fissare il colino in acciaio inossidabile alla piastra scanalata, piegare delicatamente il collo del colino con l'aiuto di una pinza in modo da orientare la base con un angolo simile a quello di un mestolo. Se il colino utilizzato è dotato di un bordo, usare la pinza per piegare il bordo verso il basso. Questo renderà più agevole la manovra con il dispositivo.

Allineare il foro sulla maniglia del colino con i fori sulla piastra scanalata e fissare il colino utilizzando dadi e bulloni Hillman. Praticare dei fori se il colino non è dotato di fori preforati. Per iniziare a prelevare le scatole criogeniche da un contenitore, assicurarsi innanzitutto di indossare guanti criogenici.

Quindi rimuovere uno o due ripiani del congelatore per fare spazio alle manovre con il dispositivo. Successivamente, utilizzare il dispositivo fai-da-te verticale resistente al criogeno, dotato di base con robusto fermo, per raschiare delicatamente il fondo del congelatore e recuperare il contenitore caduto sul fondo del serbatoio. Infine, sollevare il dispositivo lungo le pareti del congelatore per ripescare il contenitore dal serbatoio.

Si noti che il dispositivo deve essere tenuto in posizione verticale e sollevato direttamente verso l'alto per evitare che la scatola scivoli nuovamente all'interno del dewar. Per recuperare le provette criogeniche, utilizzare la spatola criogenica dotata di un setaccio per raschiare delicatamente il fondo del dewar, in modo analogo al recupero delle scatole criogeniche; quindi sollevare il dispositivo in posizione verticale e prelevare le provette raccolte nel setaccio. Una sfida importante negli studi sull'espressione genica è che la qualità dell'RNA dipende dalle condizioni di conservazione sia dei campioni di tessuto congelati sia dell'RNA estratto.

Questa figura mostra l'effetto della manipolazione del campione sull'integrità dell'RNA totale; l'RNA totale proveniente dalla stessa fonte tissutale è stato sottoposto a diverse modalità di trattamento del campione prima dell'esperimento. L'RNA totale integro mostra bande chiare di RNA ribosomiale 28S e 18S, con la banda di RNA ribosomiale 28S circa due volte più intensa della banda di RNA ribosomiale 18S. Questo indica che l'RNA è integro. Le corsie tre e quattro mostrano campioni con degradazione significativa dovuta a ripetuti scongelamenti parziali causati da prelievi a breve termine dal congelatore, simulando così una conservazione a lungo termine con scongelamenti periodici necessari per il recupero di provette cadute nelle scatole.

Tuttavia, i campioni conservati nel servizio doer utilizzando il dispositivo fai-da-te e quindi privi di scongelamento parziale contengono RNA integro nella corsia due. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come recuperare i campioni dall'unità dvar riempita di azoto liquido senza la necessità di travasarla.