Un liquido fase di cattura test affinità utilizzando biglie magnetiche per studiare interazioni proteina-proteina: il poliovirus-Nanobody Esempio

Questo protocollo utilizza l'interazione tra il poliovirus e i nanocorpi specifici per il poliovirus per dimostrare un semplice saggio quantitativo di cattura per affinità in fase liquida. In linea di principio, si utilizzano microsferette magnetiche rivestite di cobalto per isolare le proteine marcate insieme a eventuali proteine radioattive interagenti. Per prima cosa, mescolare le proteine marcate e quelle etichettate e incubare a temperatura ambiente.

Quindi aggiungere le perle magnetiche che riconoscono il marcatore, separare la frazione legata della proteina marcata dalla frazione non legata utilizzando magneti. Successivamente misurare il segnale della proteina marcata presente nella frazione non legata e determinare la quantità di proteina marcata presente nella frazione non legata. I risultati di questo saggio di affinità in fase liquida sono estremamente utili quando si analizzano proteine sensibili alla conversione conformazionale.

Questo saggio di cattura per affinità in fase liquida può fornire informazioni sull'interazione tra il poliovirus, nanoanticorpi riconoscibili e diversi antigeni del poliovirus. Il metodo può essere applicato anche ad altre interazioni proteina-proteina, a condizione che una proteina possa essere marcata e l'altra possa essere rilevata. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando eravamo interessati a studiare l'interazione tra il poliovirus, nanoanticorpi riconoscibili e diversi antigeni del poliovirus.

Poiché il virus della poliomielite è sensibile alla conversione conformazionale, quando è legato a una superficie solida, l'uso dell'LSA è limitato. Pertanto, si dovrebbe preferire un sistema basato su fase liquida. Un esempio di tale sistema basato su fase liquida, spesso utilizzato nella ricerca sul virus della poliomielite, è il micro protein.

Un saggio di immunoprecipitazione. Anche se questo test ne ha dimostrato l'applicabilità, richiede la struttura cristallizzata di un anticorpo convenzionale, che è assente nei nanocorpi. Questi nanocorpi, che sono anticorpi monocatenari interessanti e molto stabili, possono essere facilmente ingegnerizzati con testi diversi.

Il sistema ampiamente utilizzato. Lo stack mostra affinità per ioni bivalenti, come nichel e cobalto, che a loro volta possono essere facilmente rivestiti su microsferette magnetiche. Abbiamo quindi sviluppato un semplice saggio quantitativo di cattura per affinità basato su microsferette magnetiche rivestite con cobalto.

Vortexare il stock di perle magnetiche e trasferire 10 microlitri per ogni campione in un tubo; pellettare le perle utilizzando un magnete. Rimuovere il sopranatante per lavare le perle. Aggiungere 150 microlitri di buffer di legame.

Raccogliere le perle utilizzando un magnete ed eliminare il soprannatante dopo un secondo lavaggio. Risospendere le perle in 40 microlitri di buffer di legame per ogni campione da controllare. Per il fondo nel campione uno, preparare una pozzetta senza virus radioattivo, ma con volume uguale di buffer di legame come controllo.

Campione due con attività radioattiva al 100%. Aggiungere tutti i componenti in una pozzetta, sostituendo il nanocorpo con il buffer di legame. Aggiungere ora 2000 conteggi al minuto di poliovirus etichettato con S 35, ceppo sette di tipo uno, in un volume totale di 80 microlitri di buffer di legame a tutti i campioni.

Accettare il controllo. Campione uno. Aggiungere 10 microlitri di diluizione del nanocorpo a ciascun campione.

Mescolare bene per 10 secondi su un agitatore e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere 40 microlitri della sospensione di perle magnetiche lavate e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente sotto agitazione continua, pellettizzare le perle con un magnete e trasferire il sopranatante chiarificato in una provetta per misurare la radioattività di ogni campione; trasferire 50 microlitri del sopranatante in un flacone per conteggio. Aggiungere tre millilitri di miscela di liquido scintillante e leggere su questo isolamento.

Contro-pesare le perline magnetiche usate in un tubo con acqua e centrifugare a 500 ×g per due minuti. Eliminare il soprannatante e risospendere le perline in sei millilitri di idrossido di sodio 0,5 M. Quindi aliquotare la sospensione in più tubi e incubare in un bagno ad ultrasuoni per cinque minuti.

Dopo aver centrifugato le perline con un magnete e aver rimosso il sopranatante, aggiungere un millilitro di soluzione al 2% di SDS in ogni provetta, quindi mescolare mediante vortex e coprire con stagnola per cinque minuti. A questo punto, raccogliere le perline. Aggiungere un millilitro di EDTA 0,2 molare a pH 7 in ogni provetta e incubare le provette in un bagno ad ultrasuoni per cinque minuti.

Quindi raccogliere le perle, lavarle con un millilitro di acqua per tre volte, seguito da un millilitro di soluzione di cloruro di cobalto 10 millimolare. Posizionare i tubi su un agitatore per 10 minuti. Procedere quindi raccogliendo le perle su un magnete e risospendendole in un millilitro di buffer di legame.

Lavare due volte in un millilitro di etanolo al 20%, quindi risospendere infine le perle nel loro volume originale di etanolo al 20% per ottenere perle rigenerate a una concentrazione di 40 milligrammi per millilitro. Correggere la radioattività di fondo impostando il controllo. Campionare il primo come valore di radioattività dello 0% e il secondo campione di controllo come valore di radioattività del 100%.

Ora, per ogni campione, calcolare la percentuale di radioattività nel pellet come misura della precipitazione complessiva del virus marcati con radioisotopi mediata dal nanocorpo. Questo esperimento valuta l'affinità di PVSS 38 C e di un anticorpo specifico per il poliovirus utilizzando tre diversi antigeni del poliovirus: antigene nativo, antigene riscaldato e subunità 14 s. In modo interessante, la radioattività nel pellet dei campioni contenenti le subunità 14 s marcate con radioisotopi diminuisce all'aumentare della concentrazione del nanocorpo PVSS 38 C. Ciò indica un aumento della quantità di subunità 14 s del poliovirus legate al nanocorpo PVSS 38 C e, indirettamente, alle microsferette magnetiche.

Dato che non si osserva alcuna affinità del pvs S 38 C per la forma antigenica N e la forma antigenica H del poliovirus, il nanocorpo appare specifico per la subunità 14 s del poliovirus. L'affinità del nanocorpo nei confronti dei suoi antigeni, misurata con questo metodo, è specifica poiché il nanocorpo non correlato NB uno non mostra alcuna reattività contro le tre forme antigeniche del poliovirus.

Questo sistema produce un'elevata riproducibilità, come indicato da questa curva di risposta alla dose generata da diversi ricercatori in giorni diversi. Una volta padroneggiato, questo affidabile saggio di cattura per affinità in fase liquida può essere eseguito correttamente entro due ore, inclusa la rigenerazione delle perle. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare questo saggio di cattura per affinità in fase liquida basato su perle magnetiche nello studio dell'interazione tra diverse proteine, specialmente quando non è possibile utilizzare sistemi basati su fase solida.