Istituzione di microbiche colture di arricchimento eucariotiche da un chimicamente Stratificati Antarctic Lake e valutazione del potenziale fissazione del carbonio

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre colture di arricchimento di protisti dal Lago Bonnie antartico e misurare la fissazione del carbonio come parte di un indicatore iniziale della diversità metabolica. Questo viene ottenuto prelevando inizialmente campioni d'acqua a diverse profondità del Lago Bonnie corrispondenti ai picchi noti di protisti e fitoplancton. I campioni d'acqua vengono quindi inoculati in diversi mezzi di crescita e incubati in una camera di crescita dotata di regolatore di temperatura e illuminazione per quattro-sei settimane.

Le colture possono essere trasportate secondo necessità a quattro gradi Celsius. Il passo successivo consiste nell'estrazione di lisati cellulari grezzi dalle colture di arricchimento. L'ultimo passaggio di questa procedura è la valutazione del potenziale di fissazione del carbonio nel lisato cellulare mediante un saggio con radioisotopi per la ribulosio uno cinque Bisfosfato, carbossilasi, ossigenasi, o attività Rubis co.

Infine, le colture di arricchimento pro mostrano una variazione del potenziale di fissazione del carbonio nella comunità naturale di protisti. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande fondamentali riguardanti l'ecologia microbica dei laghi, ad esempio al ruolo dei eucarioti microbici nel ciclo del carbonio in diverse fasi nei laghi antartici stratificati.

Sebbene il campionamento della colonna d'acqua per generazioni successive di colture di arricchimento sia una tecnica frequentemente utilizzata, questo metodo include modifiche per operare in un ambiente estremamente freddo in cui possono verificarsi complicazioni impreviste. Ho avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando stavo pensando a dei modi per testare il saggio Redisco in campioni naturali di lago. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i passaggi di campionamento sono difficili da immaginare, dato che i siti di campionamento si trovano in un ambiente estraneo a molti ricercatori.

I campioni vengono prelevati dal Lago Bonnie, uno dei numerosi laghi permanentemente ricoperti di ghiaccio situati nelle Valli Secche di McMurdo in Antartide, un giorno prima del campionamento della colonna d'acqua. Ciò permetterà ai livelli stratificati della colonna d'acqua di riformarsi dopo il disturbo causato dalla perforazione e dallo scioglimento del foro nel ghiaccio. Identificare la posizione del sito di perforazione mediante GPS per accedere alla colonna d'acqua.

Iniziare praticando un foro nel ghiaccio con un trapano Jiffy Ice collegato a un'estensione Jiffy da quattro pollici e a un utensile tagliente per evitare il congelamento del trapano nel foro. Evitare di trapanare nell'acqua liquida fermandosi a circa quattro-sei pollici sopra l'inizio della colonna d'acqua. Il foro praticato deve essere allargato da un diametro di sei pollici a due piedi per consentire il campionamento.

Questo viene effettuato utilizzando uno scioglitore di fori basato su un modello ad acqua calda, che circola polietilene glicole riscaldato attraverso un foro in un tubo di rame. La fusione richiede tipicamente fino a 18 ore, il giorno precedente il campionamento della colonna d'acqua. Assicurarsi che tutto l'equipaggiamento necessario e i contenitori per lo stoccaggio dei campioni siano assemblati sul sito di campionamento.

Il materiale per il campionamento comprende una bottiglia NICU con capacità da cinque a dieci litri, un argano con cavo calibrato in profondità, un numero sufficiente di contenitori per campioni per ogni profondità di campionamento, un percussore e contenitori termici per il trasporto dei campioni. Iniziare il campionamento presto nella giornata, intorno alle 5:00, poiché la filtrazione dell'acqua del lago deve essere completata nella stessa giornata del campionamento. Utilizzare un campionatore kin collegato a un argano manuale calibrato.

Prelevare campioni d'acqua da uno a cinque litri dalle profondità desiderate per questo studio. Le profondità di campionamento sono di sei metri, 15 metri e 18 metri misurate dal livello dell'acqua simmetrico rispetto al PI nel foro nel ghiaccio. Conservare i campioni del lago in contenitori termici e trasportarli dal sito di campionamento al laboratorio di campo.

Utilizzando una slitta collegata a un ATV, i campioni devono essere processati o stabilizzati nel laboratorio sul campo. Immediatamente dopo il campionamento, la coltivazione di colture di arricchimento dovrebbe iniziare non appena i campioni sono stati trasportati nel laboratorio sul campo. Concentrare da 0,5 a un litro di acqua di lago su un filtro da 47 millimetri con porosità di 0,45 micron.

Filtrare delicatamente utilizzando filtri in polieter solfone. Se si desidera la diversità della comunità naturale, filtrare un secondo campione su un filtro di 47 millimetri con una dimensione dei pori di 0,45 micron.

I filtri in polietersolfone vengono congelati rapidamente in azoto liquido. Trasferire ciascun filtro in un tubo sterile da 50 millilitri contenente circa 20 millilitri di acqua di lago filtrata, prelevata dalla stessa profondità di campionamento del filtro.

Trasferire la sospensione cellulare in un’aliquota sterile da 25 centimetri quadrati per arricchimenti su diversi mezzi di coltura. Impostare multipli repliche per ogni profondità di campionamento. Aggiungere ad ogni flacone di coltura 50 x soluzioni sterili dei seguenti mezzi di coltura, bold basil, medium, BG 11 e F due.

Se è necessaria la coltivazione di organismi mixotrofi atrofici, preparare due contenitori F2 supplementati e aggiungere due o tre chicchi di riso sterile a uno dei flaconi di coltura, quindi incubare a bassa temperatura e ridotta radiazione in un incubatore climatizzato per almeno quattro settimane prima della spedizione al laboratorio statunitense. Trasferire le colture di arricchimento in provette Falcon sterili da 50 millilitri. Nella richiesta di spedizione, indicare esplicitamente di non congelare e mantenere fresco. Al ricevimento negli Stati Uniti, trasferire cinque millilitri di ciascuna coltura di arricchimento in 45 millilitri di terreno di crescita appropriato in un contenitore da 125 millilitri.

Flacone erlenmeyer sterile con tappo in spugna sterile. Mantenere le colture di arricchimento come colture stazionarie in una camera di crescita ambientale a controllo termico a quattro gradi Celsius e trasferire con trasferimento a radianza ridotta le colture su mezzo fresco ogni 30 giorni. Per iniziare la procedura di estrazione del lisato cellulare, filtrare cinque litri di coltura di arricchimento su un filtro Watman GFF da 25 millimetri utilizzando un vuoto delicato.

Successivamente, tagliare il filtro in quattro o cinque sezioni con forbici sterili di acciaio. Quindi utilizzare pinze sterili per trasferire i pezzi in un tubo con tappo a vite da due millilitri riempito per un quinto con diametro di 0,1 millimetri.

Perline di zirconia e silice. Aggiungere 1,25 millilitri di tampone di estrazione per filtrazione nel tubo, quindi rompere le cellule utilizzando un omogeneizzatore a perline miniaturizzato per 30 secondi a una velocità di 48, seguito da un raffreddamento sul ghiaccio per un minuto. Ripetere ulteriormente due volte l'omogeneizzazione a perline, intervallata da incubazioni sul ghiaccio di un minuto ciascuna, per prevenire il surriscaldamento del campione durante la centrifugazione.

Filtrare la sospensione per due minuti a 3000 volte G a quattro gradi Celsius. Per formare un aggregato morbido di fibre del filtro GFF e detriti della parete cellulare. Rimuovere un'aliquota di 200 microlitri del surnatante e immergerla in 800 microlitri di acetone al 90% freddo di ghiaccio.

Trasferire il surnatante rimanente in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Misurare la clorofilla A estraibile mediante spettrofotometro a valori di lunghezza d'onda di 664 nanometri e 647 nanometri. Centrifugare il surnatante SUP rimanente per due minuti a 15.000 ×g a quattro gradi Celsius.

Trasferire l'S in un tubo pulito da 1,5 millilitro per microcentrifuga, evitando il pellet costituito dalle membrane cellulari insolubili e dalle restanti fibre del filtro GFF. Questo lisato cellulare solubile può ora essere utilizzato nel saggio di attività della rubisco carbossilasi, che verrà illustrato successivamente. Per iniziare questo saggio, trasferire 125 microlitri di ciascun lisato solubile in un tubo da microcentrifuga con tappo a vite da 1,5 millilitri precedentemente raffreddato sul ghiaccio.

Per i campioni di controllo negativo, aggiungere 125 microlitri di lisato solubile in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitro con tappo a vite, ma non aggiungere il substrato. Successivamente eseguire reazioni duplicate per tutti i campioni e i controlli negativi. Preparare 10 millilitri di tampone per il saggio, fresco e raffreddato su ghiaccio.

Aggiungere una quantità sufficiente del buffer per il saggio per tutti i campioni e i controlli negativi in un tubo da cinque millilitri. Da questo punto in poi, tutti i passaggi devono essere eseguiti sotto cappa. Aggiungere bicarbonato di sodio marcato con C 14 al buffer assegnato e mantenere il buffer sul ghiaccio.

Rimuovere 10 microlitri del buffer del saggio contenente C 14 e diluirli in un millilitro di buffer del saggio invertito. Per miscelare, aggiungere 100 microlitri della miscela diluita a tre millilitri di cocktail per conteggio scintillometrico Bios Safe 2 in un vial per scintillazione e capovolgere per miscelare. Misurare i conteggi di C 14 con un contatore Beckman LS 6,500; i conteggi scintillometrici devono essere superiori a 18.000 conteggi al minuto prima di proseguire con il saggio.

Una volta aggiunta una quantità sufficiente di bicarbonato di sodio marcato con C 14 al buffer del saggio, trasferire le provette in un bagno asciutto preriscaldato a 25 gradi Celsius e incubare per tre-cinque minuti. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di buffer del saggio ai lisati e incubare a 25 gradi Celsius per cinque minuti. Trascorsi cinque minuti, aggiungere il ribulosio bifosfato a ciascun campione e lasciare procedere la reazione per cinque-dieci minuti a 25 gradi Celsius.

Per arrestare la reazione, aggiungere 100 microlitri di acido probiotico al 100%, centrifugare per un'ora a 2000 ×g per rimuovere il C14 non incorporato. Infine, trasferire il volume totale dei campioni in vial per scintillazione contenenti tre millilitri di bios. Aggiungere due millilitri di cocktail per conteggio a scintillazione e determinare i conteggi al minuto della frazione stabile all'acido.

Prodotti finali mediante conteggio con scintillazione. È stata utilizzata una coltura di arricchimento per isolare nuovi protisti fototrofi e mistotrofi adattati al freddo dal lago antartico Bonnie a tre profondità diverse. Sono stati utilizzati diversi tipi di mezzi di crescita per selezionare una maggiore diversità di organismi: mezzo BBMF due si, mezzo marino e mezzo BG 11.

La concentrazione di nutrienti e la radiazione fotosinteticamente attiva o PAR mostrate in questa tabella rappresentano le condizioni al momento del prelievo del campione. L'ispezione visiva dei colture arricchite mediante microscopia ottica ha rivelato che le colture erano dominate da protisti fototrofi, come indicato dalla presenza del pigmento clorofilliano nella maggior parte delle cellule. Le colture contenevano inoltre una varietà di morfologie cellulari, a seconda della profondità di campionamento da cui era stato ottenuto l'inoculo e del tipo di mezzo utilizzato nella coltura.

Le velocità massime dell'attività della carbossilasi catalizzata dall'enzima rubis sono state misurate nelle colture arricchite come indicatore della fissazione del carbonio. L'abbondanza potenziale di clorofilla A è stata inoltre monitorata come stima della biomassa dei protisti fototrofi, come mostrato qui.

Nonostante la coltivazione di tutte le colture alla stessa temperatura, il potenziale di fissazione del carbonio e la biomassa fototrofica variano notevolmente tra le colture arricchite. L'attività massima della rubis O è stata osservata nelle colture arricchite quattro e sei cresciute in mezzo BBM e nelle colture arricchite 13 e 14 cresciute in mezzo BG11. Al contrario, le colture 1921 e 23 arricchite nel mezzo di crescita F2 hanno mostrato attività massime della carbossilasi da quattro a 34 volte inferiori.

Queste differenze non erano dovute a livelli più bassi di biomassa nelle colture F2, poiché l'attività della carbossilasi è stata espressa in base alla clorofilla a. Inoltre, un'analisi di correlazione di Pearson ha rivelato che l'attività della rubisco non era correlata alla concentrazione di clorofilla a. Le colture BBM sono state inoculate con acqua di lago prelevata a sei metri e a quindici metri.

Il recinto di arricchimento numero cinque ha mostrato i livelli più elevati di clorofilla A, mentre tutte le altre colture hanno mostrato concentrazioni relativamente basse di clorofilla a, indipendentemente dall'attività dell'enzima rubis. Una volta acquisite, le tecniche di campionamento del lago richiedono circa due ore per essere eseguite. A seconda del numero di campioni prelevati, il saggio della carbossilasi richiede anch'esso circa due ore se eseguito correttamente. Seguendo questa procedura, altri metodi, come il saggio dell'attività enzimatica eterotrofa, possono essere utilizzati per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio a quale profondità si verifica l'eterotrofo. Bene, dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come raccogliere campioni di lago, arricchirli per la produzione e sottoporli a saggio per l'attività della carbossilasi rubis.