Caricamento in corso retrogrado di Nervi, tratti e radici spinali con le tinture fluorescenti
19 aprile 2012
Descriviamo una tecnica semplice ea basso costo per introdurre alta concentrazione di coloranti fluorescenti e calcio-sensibili in neuroni o qualsiasi tratto neuronale mediante una pipetta di aspirazione polietilene.
L'obiettivo generale di questa procedura è introdurre una concentrazione elevata di colorante fluorescente o sensibile agli ioni nei neuroni o in qualsiasi tratto neuronale, utilizzando una tecnica semplice ed economica. Questo risultato si ottiene innanzitutto producendo due tipi di pipette, tipo uno e tipo due. Successivamente, si collega un tubo flessibile in elastomero alla pipetta di tipo uno ed si applica una pressione positiva per aspirare il tratto neuronale bersaglio all'interno della pipetta di tipo uno, verificando che si formi un buon sigillo.
Successivamente, inserire la pipetta di tipo due nella pipetta di tipo uno ed utilizzare la pipetta di tipo due per aspirare il residuo di A CSF dalla pipetta di tipo uno. Quindi introdurre il colorante, ma nessuna bolla d'aria, nella pipetta di tipo uno. L'ultimo passaggio consiste nell'incubare i neuroni al buio per un periodo compreso tra sei e 20 ore.
Infine, dopo la rimozione della pipetta di tipo uno, il preparato è pronto per studi in vitro di elettrofisiologia o morfologici. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'applicazione in bagno, l'iniezione BOS e l'elettroporazione è che il D viene consegnato a una popolazione neuronale definita. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, come l'attività, la connettività, la morfologia e la distribuzione di neuroni definiti.
In generale, la tecnica richiede pratica, in particolare per garantire che il colorante non si diluisca all'interno della pipetta di tipo uno e che non vengano introdotte bolle d'aria. Iniziare questa procedura facendo passare il tubo in polietilene sulla fiamma di una lampada ad alcol per produrre due brevi pipette con punte coniche. Per prima cosa, formare una breve pipetta di tipo uno con una punta piccola in grado di trattenere saldamente la radice o il tratto bersaglio.
Successivamente, prendere una pipetta di tipo due con un'asta più lunga e sottile e una punta molto fine, che può essere inserita nella pipetta di tipo uno fino alla sua estremità. In seguito, collegare la pipetta di tipo due a un ago da 19 gauge con clip EC. Quindi, posizionare il midollo spinale isolato in un bagno.
Unire saldamente con A CSF freddo per tutta la durata del caricamento. Successivamente, posizionare la pipetta di tipo uno su un porta-elettrodo in modo che la sua apertura posteriore possa essere facilmente collegata a una siringa mediante un tubo flessibile. In questa procedura, aspirare innanzitutto il CSF nella pipetta di tipo uno utilizzando una siringa.
Successivamente, disegnare il tratto assonale o la radice da riempire. Poi rimuovere il tubo flessibile dall'apertura posteriore. Successivamente, collegare la pipetta di tipo due a un'altra siringa.
Inserirla nella pipetta di tipo uno, che sta trattenendo un tratto assonale o una radice neuronale sotto il microscopio. Utilizzare la siringa collegata alla pipetta di tipo due per aspirare il LCS A in modo che il residuo di LCS A copra appena il tratto assonale. Successivamente, ritirare la pipetta di tipo due dalla pipetta di tipo uno.
Monitorare il livello di CSF A per alcuni minuti per verificare un'adeguata tenuta del tratto assonale o dei nervi. Successivamente, sciogliere il colorante in CSF A o in Triton X-100 0,2% in acqua doppia distillata. Aspirarlo nella pipetta di tipo due applicando una debole pressione negativa alla siringa collegata, avendo cura di non aspirare bolle d'aria.
Quindi inserire la pipetta di tipo due contenente il colorante nella soluzione residua di CSF A presente nella pipetta di tipo uno, rilasciando lentamente il colorante nel CSF A mediante una leggera pressione positiva sulla siringa. Accertarsi di non introdurre bolle d'aria né di provocare lo spostamento del tessuto bersaglio dall'interno della punta. Se durante l'iniezione del colorante viene introdotta una bolla d'aria nella pipetta di tipo uno, rimuovere la bolla avvicinando la punta della pipetta di tipo due alla bolla stessa, quindi applicando delicatamente una debole pressione negativa tramite la siringa collegata.
Dopo che è stata rilasciata una quantità sufficiente di colorante, rimuovere la pipetta di tipo due. Successivamente, incubare il tessuto al buio per un periodo compreso tra sei e 20 ore, a seconda del tipo di esperimento. Una volta trascorso un tempo sufficiente per il riempimento, staccare delicatamente l'elettrodo dal tessuto.
Quindi il tessuto è pronto per l'analisi mediante imaging o istologia. Di seguito è riportato uno schema che illustra il caricamento simultaneo di tre diversi dextrani fluorescenti coniugati: i motoneuroni, le afferenze sensitive e i neuroni intercalati del midollo spinale sono stati retrogradamente riempiti con Cascade blue Dextran e Texas red dextran, rispettivamente attraverso le radici ventrali e dorsali. Il dextrano fluorescente verde è stato caricato nei neuroni intercalati spinali i cui assoni decorrono in senso ascendente attraverso il funicolo ventrale.
Qui è mostrata un'immagine confocale di una sezione del midollo spinale sacrale in cui i neuroni sono stati marcati retrogradamente. Si noti che gli afferenti sensitivi marcati sono principalmente ipsilaterali. Con alcune proiezioni controlaterali, i neuroni motori marcati sono ipsilaterali alla radice ventrale riempita, mentre i neuroni intercalati marcati sono controlaterali rispetto ad essa, come indicato dalla testa di freccia.
Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti ulteriori metodi al fine di rispondere a domande fondamentali riguardo la connettività funzionale, l'inibitore eccitatorio, il tipo di seno, la distribuzione e la produzione di neurotrasmettitori nei neuroni del campo DI. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neurofisiologia del midollo spinale e del tronco encefalico, permettendo di rilevare popolazioni neuronali specifiche mediante l'uso di coloranti sensibili agli ioni. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come applicare coloranti fluorescenti e/o sensibili agli ioni sui neuroni e sulle fibre sensoriali nel midollo spinale isolato.
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Panoramica
Questo articolo descrive una tecnica semplice ed economica per introdurre alte concentrazioni di coloranti fluorescenti e sensibili al calcio in neuroni o tratti neuronali. Il metodo utilizza una pipetta da aspirazione in polietilene per ottenere un'efficace introduzione del colorante.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Immagini fluorescenti
Sfondo
- I coloranti fluorescenti e sensibili al calcio sono essenziali per lo studio dell'attività neuronale.
- I metodi tradizionali possono essere costosi o complessi.
- Questa tecnica mira a semplificare il processo.
- L'utilizzo di una pipetta da aspirazione in polietilene migliora l'accessibilità per i ricercatori.
Scopo dello studio
- Introdurre efficacemente alte concentrazioni di coloranti nei neuroni.
- Fornire un'alternativa economicamente vantaggiosa ai metodi esistenti.
- Facilitare una migliore visualizzazione dell'attività neuronale.
Metodi Utilizzati
- Produzione di due tipi di pipette per la procedura.
- Applicazione di una pressione positiva per aspirare il tratto neuronale bersaglio nella pipetta.
- Utilizzo di una seconda pipetta per aspirare il liquido cerebrospinale residuo.
- Introduzione del colorante senza bolle d'aria, seguita da incubazione al buio.
Risultati principali
- La tecnica consente un efficace inserimento del colorante nei neuroni.
- È possibile raggiungere alte concentrazioni di coloranti con costi minimi.
- Il tempo di incubazione varia da sei a venti ore per ottenere risultati ottimali.
- Il metodo è riproducibile e accessibile per i ricercatori.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce un modo affidabile per introdurre coloranti nei sistemi neuronali.
- Migliora la capacità di studiare la dinamica e le funzioni neuronali.
- L'approccio è vantaggioso sia per scopi di ricerca che educativi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questa tecnica consente un'accurata somministrazione di coloranti fluorescenti e sensibili agli ioni a popolazioni neuronali definite, supportando la riduzione dei rischi meccanicistici nella validazione degli obiettivi e nell'analisi dei percorsi. Mantenendo un'elevata concentrazione del colorante durante il caricamento, migliora l'affidabilità del segnale per saggi funzionali e morfologici successivi. L'approccio economico e riproducibile potenzia la standardizzazione e la scalabilità dei saggi nei flussi di lavoro della fase iniziale della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di specifici tratti neuronali per chiarire le ipotesi relative alla connettività e alla funzionalità.
- Valore operativo: Fornisce una popolazione neuronale definita per studi coerenti sull'attivazione del bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative di fluorescenza per valutare l'assorbimento del colorante e l'efficienza di marcatura neuronale.
- Valore operativo: Favorisce la prontezza del saggio attraverso la somministrazione standardizzata del colorante senza bolle e protocolli di incubazione riproducibili.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita la modellizzazione di sistemi pertinenti alle malattie consentendo la visualizzazione delle popolazioni di motoneuroni, sensoneuroni e interneuroni in preparati del midollo spinale.
- Valore operativo: Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica mediante un'etichettatura neuronale affidabile per elettrofisiologia e imaging.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nella biologia della scoperta consentendo l'etichettatura mirata dei neuroni, sostenendo la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi. Si evolve verso lo screening fornendo preparazioni pronte per il saggio con output quantitativi dipendenti dal colorante. La tecnica contribuisce all'analisi attraverso parametri misurabili di intensità e distribuzione della fluorescenza. Supporta la ricerca traslazionale mantenendo l'integrità neuronale per studi di continuità preclinica. Il riutilizzo aziendale è reso possibile da un sistema a basso costo e adattabile basato su pipette, applicabile a diversi tratti neuronali.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'etichettatura definita dei tratti neuronali.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio attraverso l'introduzione standardizzata di colorante ad alta concentrazione senza diluizione.
- Analisi: Permette misurazioni quantitative dell'intensità di fluorescenza e della distribuzione neuronale per l'analisi comparativa tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica preservando la morfologia e la funzione neuronale dopo l'etichettatura.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile e a basso costo per un'etichettatura neuronale costante in diversi modelli sperimentali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica negli studi sulla connettività neuronale e sull'attività neuronale.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità grazie alla preparazione standardizzata delle pipette e al rilascio standardizzato del colorante.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione (go/no-go) fornendo dati affidabili sull'interazione con i target neuronali e sulla modulazione dei percorsi.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio grazie a un'etichettatura neuronale coerente e ad alta fedeltà in tutte le fasi della scoperta.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in microchirurgia e visualizzazione microscopica per una corretta manipolazione della pipetta e gestione dei tessuti.
- Presuppone l'accesso a tubi in polietilene, sistemi a siringa e microscopia a fluorescenza per il caricamento e il rilevamento del colorante.
- Necessita di una standardizzazione tra i gruppi riguardo alle tecniche di trazione delle pipette e alle condizioni di incubazione per garantire una marcatura uniforme.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si applica il metodo a diversi tratti neuronali o sistemi modello con diametri assonali variabili.
- Comprende limitazioni pratiche, come la necessità di evitare l'introduzione di bolle d'aria e di mantenere l'integrità del sigillo durante il caricamento del colorante.
