Singolo ovociti Mutagenesi bisolfito

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare la metilazione del DNA in un singolo ovocita. Questo viene ottenuto innanzitutto rimuovendo le cellule del cumulo e il sapone palita dagli ovociti raccolti. Il secondo passaggio consiste nell'includere l'ovocita in una soluzione di lisi aros in rapporto due a uno per proteggere la minima quantità di DNA dalla perdita o degradazione.

Successivamente viene eseguita la mutagenesi con bisolfito, seguita dall'amplificazione mediante reazione a catena della polimerasi annidata. L'ultimo passaggio consiste nel legare e clonare il prodotto della PCR. I cloni vengono quindi selezionati, amplificati mediante PCR e inviati per il sequenziamento.

In definitiva, la mutagenesi con bisolfito e il sequenziamento vengono utilizzati per evidenziare la metilazione del DNA a livello dei dinucleotidi citosina-fosfato-guanina, o dinucleotidi CpG, in una regione di interesse all'interno di un singolo ovocita. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la mutagenesi con bisolfito su un elevato numero di cellule, è che i dati possono essere ottenuti da un singolo ovocita senza ricorrere al pooling di cellule, riducendo così il rischio di bias nella PCR e la contaminazione da cellule somatiche. Nel giorno del prelievo degli ovociti, preparare frescamente le soluzioni elencate nel protocollo scritto; per ridurre la probabilità di contaminazione del DNA, cambiare spesso i guanti, utilizzare punte filtranti, mantenere i tubi inclinati quando sono aperti e richiuderli sempre quando non sono in uso.

Iniziare la raccolta di OSI posizionando le ovidutti di topo dissecati nel mezzo M due e lacerando il polmone M per estrarre il complesso cellulare del cumulo. Successivamente, separare le cellule dal complesso cellulare del cumulo utilizzando una soluzione di igaluronidasi a 0,3 milligrammi per millilitro in una goccia di 30 microlitri di mezzo M due. Mantenere le cellule in soluzione solo per il tempo necessario a rimuovere le cellule del cumulo, poiché un'esposizione prolungata potrebbe danneggiarle.

Lavare gli oociti in gocce da 30 microlitri di mezzo M due, trasferendo gli oociti da una goccia all'altra. Rimuovere periodicamente le cellule del cumulo per un totale di tre lavaggi. Rimuovere la Z di LUCITA utilizzando soluzione acida di Tyro.

Posizionare innanzitutto le ovociti in una goccia di soluzione da 30 microlitri, quindi trasferirle in un'altra goccia da 30 microlitri. Qualsiasi mezzo trascinato diluirebbe l'acido riducendone l'efficacia. Mantenere le ovociti in soluzione solo per il tempo necessario a rimuovere la zona pellucida, poiché un'esposizione prolungata potrebbe danneggiarle.

Dopo la rimozione della zona, lavare nuovamente le cellule in una goccia di 30 microlitri di mezzo M due per eseguire l'inclusione in agarosio. Posizionare prima la soluzione di lisi su un blocco termico a 70 gradi Celsius. Aggiungere l'agarosio a basso punto di fusione, o LMP Agros, alla soluzione di lisi, ottenendo un rapporto di due a uno tra AGROS e soluzione di lisi. Quindi posizionare un singolo ovocita su un vetrino pulito in minima quantità di mezzo M due.

Il passaggio successivo consiste nell'inserire il singolo citoplasma nella soluzione di agarosio e di lisi. Questa operazione deve essere eseguita rapidamente poiché l'agarosio si solidifica a temperature inferiori a 65 gradi Celsius. Aspirare 10 microlitri della soluzione di agarosio e lisi in una punta di pipetta sotto un microscopio.

Espellere delicatamente circa un microlitro o meno della soluzione di lisi agros sul vetrino, permettendo che si mescoli con il mezzo minimo. Raccogliere delicatamente l'ovocita nella punta della pipetta. Quindi trasferire tutti i 10 microlitri in una provetta einor contenente 300 microlitri di olio minerale, in modo che la goccia risultante assuma una forma sferica.

Incubare il tubo sul ghiaccio per 10 minuti per eseguire la lisi. Rimuovere 300 microlitri di olio minerale e aggiungere 500 microlitri del buffer di lisi SDS. Incubare il campione tutta la notte in un bagno termico impostato a 50 gradi Celsius il secondo giorno.

Preparare le soluzioni per la mutagenesi con solfuro di idrogeno fresche, come descritto nel protocollo scritto. Iniziare la mutagenesi rimuovendo completamente i 500 microlitri di tampone di lisi SDS. Tenere presente che qualsiasi tampone di lisi residuo diluirà l'agros quando verrà riscaldato e le perle risulteranno più suscettibili a sciogliersi nei passaggi successivi.

Dopo aver completamente rimosso il buffer di lisi, aggiungere 300 microlitri di olio minerale. Incubare il campione per due minuti e mezzo su un blocco termico a 90 gradi Celsius. Prestare attenzione a non mescolare, agitare, allungare o far variare la temperatura.

Dopo due minuti e mezzo, incubare il campione sul ghiaccio per 10 minuti. Per eseguire la denaturazione, rimuovere l'olio minerale e aggiungere un millilitro di idrossido di sodio 0,1 molare al tubo; agitare e capovolgere il tubo da cinque a sei volte.

Incubare il campione per 15 minuti. In un bagno termico impostato a 37 gradi Celsius, capovolgere ogni tre o quattro minuti; la perlina dovrebbe galleggiare nell'idrossido di sodio. Notare che la perlina non si trova più sul fondo del tubo.

Per eseguire il trattamento con solfito, dopo aver rimosso l'idrossido di sodio, centrifugare delicatamente il tubo. Aggiungere 300 microlitri di olio minerale e 500 microlitri di soluzione BIS di solfito. Prestare attenzione ad evitare l'esposizione alla luce e incubare il tubo per tre ore e mezza in un bagno d'acqua a 50 gradi Celsius.

Eseguire ora la desolfonazione. Incubare prima il campione su ghiaccio per tre minuti, quindi rimuovere l'olio minerale e la soluzione di bisolfito di BIS. Dopo una centrifugazione delicata, aggiungere un millilitro di idrossido di sodio 0,3 molare, agitare e capovolgere il tubo da cinque a sei volte.

Incubare il campione per 15 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, capovolgendo ogni tre o quattro minuti. Ancora una volta, la perlina dovrebbe galleggiare nell'idrossido di sodio prima di iniziare la PCR. Lavare i campioni centrifugando delicatamente.

Quindi rimuovere l'idrossido di sodio e aggiungere un millilitro di XTE 1x a pH 7,5. Agitare per cinque-dieci minuti a temperatura ambiente. Dopo una seconda centrifugazione delicata, rimuovere l'XTE 1x.

Ripetere questo processo di lavaggio due volte. Quindi aggiungere un millilitro di acqua distillata e sterilizzata in autoclave. Agitare per cinque-dieci minuti a temperatura ambiente, centrifugare delicatamente per la terza volta ed eliminare l'acqua.

Ripetere il lavaggio con acqua distillata due volte. Infine, rimuovere tutto il soprannatante, lasciando solo la perla di aros. Verificare che il pH del soprannatante sia 5,0.

Se il surnatante è ancora troppo basico, lavare nuovamente le perle con acqua doppio distillata. Nel frattempo, aggiungere la miscela di PCR del primo round al tubo PCR come descritto nel protocollo scritto. Far scivolare il coperchio solido del microcentrifuga fino al bordo del tubo einor.

Quindi trasferire con attenzione l'agro speed nel tubo PCR e riscaldare a 70 gradi Celsius per un minuto, mescolare, quindi procedere all'amplificazione come indicato nel protocollo scritto. Dopo l'amplificazione del primo ciclo, preparare la reazione PCR del secondo ciclo utilizzando cinque microlitri del prodotto del primo ciclo come stampo. Assicurarsi di pipettare al di sotto dello strato di olio minerale.

Procedere con il secondo ciclo di amplificazione come indicato nel testo come test diagnostico. I campioni del secondo ciclo possono essere digeriti con un enzima di restrizione specifico per la metilazione o per ceppo, e i prodotti di digestione possono essere separati mediante elettroforesi su gel di acrilamide all'8%. Qualsiasi banda eterogenea risultante rappresenta più di una sequenza; per clonare il prodotto del secondo ciclo, inserirlo nel vettore ed eseguire il clonaggio TA come descritto nel manoscritto allegato a questo video. Dopo il clonaggio TA, piastrare tutta la miscela di reazione su una piastra di agar contenente LB, integrato con ampicillina, X-gal e IPTG, e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per tutta la notte.

Quindi aggiungere la miscela master per la PCR da colonie al tubo PCR come indicato nel protocollo scritto. Prelevare una colonia batterica bianca dalla piastra con la punta di una pipetta e mescolarla in 35 microlitri della miscela master per la PCR da colonie in un tubo PCR. Procedere ad amplificare la sospensione come descritto nel testo; successivamente, sottoporre a elettroforesi 4 microlitri del prodotto PCR su un gel di AGAROSIO 1,5%.

Infine, inviare circa 30 microlitri del prodotto PCR per il sequenziamento di cinque PCR da colonie per citoplasma. Una volta ottenuti i risultati del sequenziamento, i modelli di metilazione possono essere letti: ogni citosina guanina originale che è rimasta tale era metilata. Al contrario, ogni citosina guanina originale che ora è una timina guanina non era metilata a seguito dell'amplificazione PCR nidificata utilizzando primer convertiti con bisolfito.

È possibile confermare una conversione riuscita visualizzando una dimensione corretta del frammento su un gel agarosio in metafasi singole. Due ovociti rappresentano un allele parentale e in teoria possiedono un unico pattern di metilazione improntata. In tal senso, i prodotti della seconda PCR possono essere testati per verificare contaminazioni accidentali.

Un enzima di restrizione sensibile alla metilazione del DNA può essere utilizzato per digerire il prodotto della PCR del secondo round al fine di valutare se contiene un allele metilato o non metilato. In questo caso, una citosina metilata all'interno della sequenza di riconoscimento dell'enzima viene tagliata. Al contrario, una citosina non metilata che è stata convertita in timina non è più riconosciuta dall'enzima e rimane intatta. Qualsiasi campione di ovocita in metafase II che contenga sia alleli metilati che non metilati deve essere scartato, poiché indica una contaminazione da cellule del cumulo o l'inclusione del globulo polare, successivamente alla ligazione e alla trasformazione.

L'amplificazione PCR di colonie di successo può essere visualizzata su un gel AROS per assicurarsi che i campioni con la dimensione corretta del prodotto vengano inviati per il sequenziamento. In questo esempio, la dimensione prevista dell'amplicone dopo la ligazione è di 156 paia di basi. In questo caso, il clone 5 presenta una dimensione dell'amplicone errata e non dovrebbe essere inviato per il sequenziamento.

La sequenza di cinque cloni singoli provenienti da un'ovocita in metafase II dovrebbe produrre cinque profili di metilazione identici e identici tassi di conversione non CPG. Tutti i campioni che contengono più di un profilo devono essere scartati. Poiché gli ovociti in metafase II ovulati possiedono due copie cromosomiche o un corpo polare attaccato, esiste la possibilità di ottenere due profili di sequenza simili.

I dati devono essere scartati per qualsiasi citi che presentano schemi di metilazione altamente dissimili. Poiché non è possibile escludere un contaminazione da cellule del cumulo durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare innanzitutto di lavare più volte gli ovociti in mezzo fresco, dopo il trattamento HI IDE, per rimuovere il maggior numero possibile di cellule del cumulo. In secondo luogo, l'agarosio a basso punto di fusione si solidifica a temperature inferiori a 65 gradi Celsius, quindi lavorare con attenzione ma rapidamente.

Infine, il bisolfato di sodio e l'idrochinone sono sensibili alla luce, quindi provette e soluzioni devono essere avvolte nella stagnola.