Registrazione ottica di attività neurale suprathreshold con risoluzione singola cellula e single-picco

L'obiettivo generale dell'esperimento FollowMe è registrare l'attività di scarica neurale da un elevato numero di neuroni. Questo risultato si ottiene osservando l'aumento della concentrazione di calcio intracellulare nel soma di un neurone associato a ciascun potenziale d'azione, mediante microscopia a fluorescenza nel primo passaggio. L'eccitazione a due fotoni e un principio di scansione ad accesso casuale vengono utilizzati per registrare segnali fluorescenti al calcio da 40 somi neuronali con elevata risoluzione spaziale e temporale.

Nel secondo passaggio, i tempi precisi degli impulsi sono estratti dai segnali fluorescenti mediante un algoritmo di deconvoluzione. Questa tecnica può essere utilizzata per registrare l'attività impulsiva da decine di neuroni. I dati sugli impulsi possono quindi essere impiegati per misurare l'informazione reciproca, la propagazione del segnale tra popolazioni neuronali o le correlazioni neurologiche.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le registrazioni con microelettrodi, è la possibilità di registrare l'attività di scarica dei neuroni da un elevato numero di cellule appartenenti a una popolazione locale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo la funzione corticale a livello di reti neuronali locali, come l'importanza delle correlazioni nella ricerca di informazioni e i cambiamenti nella dinamica delle reti in seguito alla corticoplasticità. Per l'eccitazione a due fotoni, si utilizza un sistema laser a impulsi infrarossi con impulsi di durata femtosecondi. È richiesta una potenza elevata del laser per compensare le notevoli perdite introdotte dai componenti ottici del sistema.

Un precompensatore per sistema costituito da due prismi immette una dispersione negativa della velocità di gruppo sugli impulsi laser prima dei deflettori ottici personalizzati, per compensare la dispersione temporale introdotta dai due AOD. Due AOD con grandi aperture deflettono il fascio laser in due dimensioni. Un reticolo di diffrazione riflettente con 100 incisioni per millimetro viene posizionato a 13 centimetri dietro i AOD per compensare la dispersione spaziale introdotta dai AOD stessi. Quando si utilizzano impulsi laser brevi, il fascio laser viene indirizzato attraverso due telescopi di rilè nel collegamento della fotocamera di un microscopio diritto.

Gli iridi sono posizionati a intervalli regolari per l'allineamento dei componenti ottici. Un divisore di fascio dicromatico posto davanti all'obiettivo trasmette la luce di eccitazione nell'infrarosso al campione e riflette la luce fluorescente proveniente dal campione su un rivelatore. I rivelatori di fluorescenza in epi e in tras luce raccolgono il segnale fluorescente attraverso l'obiettivo e il condensatore; filtri in vetro colorato sono posizionati davanti ai rivelatori per impedire che la luce di eccitazione raggiunga i rivelatori.

Gli angoli di deflessione del deflettore acusto-ottico sono controllati da un computer dotato di una scheda convertitore digitale-analogica, che a sua volta pilota degli oscillatori controllati in tensione. Il segnale proveniente dai fotomoltiplicatori viene inviato attraverso un filtro passa-basso di Butterworth con una frequenza di taglio di 100 chilohertz e viene digitalizzato da un convertitore analogico-digitale con una frequenza di campionamento di 156,25 chilohertz prima di essere memorizzato su un computer per l'analisi. Allineamento e rumore elettrico vengono verificati registrando la distribuzione dei segnali fluorescenti con e senza luce laser, a guadagno basso e alto dei fotomoltiplicatori, nonché con e senza indicatore. La scansione casuale con accesso ditherato si basa sul rilevamento degli aumenti intracellulari di calcio. Il primo passo del protocollo consiste nell'impregnare un gran numero di neuroni con la forma acetossimetil estere di un indicatore di calcio mediante iniezione in bolo.

Successivamente, registrare l'attività del soma in ciascun neurone in quattro posizioni per 6,4 microsecondi in ciascuna posizione. Per selezionare i neuroni di interesse, acquisire un'immagine completa composta da 256 per 256 pixel. Quindi selezionare manualmente i centri dei neuroni da registrare all'interno di questa immagine.

Vengono aggiunti automaticamente dal software di controllo tre punti a una distanza di due micron da ciascun centro in ogni ciclo. Il segnale fluorescente viene registrato in corrispondenza dei quattro punti in tutte e 40 le neuroni. La registrazione da tutti i neuroni in un ciclo richiede 1,536 millisecondi.

Ripetere questa registrazione sequenziale di tutti e 40 i neuroni per cinque secondi. Il rilevamento dei picchi dai segnali fluorescenti calcici somatici si basa su un elevato rapporto segnale/rumore. Un elevato rapporto segnale/rumore può essere ottenuto aumentando l'intensità di eccitazione.

Tuttavia, l'intensità di eccitazione può essere aumentata solo fino a un certo limite a causa dei danni fotoindotti. Esiste solo una finestra molto ristretta di intensità di eccitazione in cui i danni fotoindotti sono ridotti e il rapporto segnale-rumore è sufficiente per rilevare singoli eventi di picco, al fine di garantire che i segnali registrati rientrino nella finestra di alta rilevabilità dei picchi. Durante un esperimento, vengono utilizzati diversi software di analisi in tempo reale sviluppati dal nostro laboratorio.

Successivamente, calcolare la velocità approssimativa di fotoni per neurone a partire da una finestra temporale breve del rumore di base della durata di circa 100-200 millisecondi. Il numero di fotoni e la velocità di fotoni vengono calcolati a partire dai valori di fluorescenza mediante l'adattamento della distribuzione delle variazioni relative di fluorescenza con questa equazione, quindi si calcola la fluorescenza di base dalla stessa finestra temporale e la si rappresenta in funzione del tempo o delle prove. Mantenere il declino medio della fluorescenza di base al di sotto di 0,0002 al secondo regolando la potenza del laser.

Perché il rilevamento dei picchi diminuisce rapidamente superando questo limite. Successivamente, verificare la posizione dei corpi neuronali ogni 10-20 minuti acquisendo un'immagine a quadro completo. Regolare le posizioni di registrazione se necessario.

I segnali fluorescenti risultanti dall'attività neurale spesso si sovrappongono nel tempo a causa del lungo decadimento del transitorio di calcio. In questo procedimento, si utilizza un metodo di deconvoluzione per ricavare gli impulsi e i relativi istanti di insorgenza a partire dai segnali fluorescenti. In questo caso, si impiega un algoritmo genetico per determinare il modello di sequenza di impulsi più probabile che si adatti al segnale fluorescente registrato.

A ogni iterazione dell'algoritmo, la massima verosimiglianza si avvicina asintoticamente al suo valore massimo, determinato dal rumore delle registrazioni di fluorescenza. Nelle popolazioni eterogenee di neuroni, il segnale calcico indotto dal potenziale d'azione può variare da un neurone all'altro. Per l'analisi non supervisionata di grandi set di dati, abbiamo progettato un algoritmo che tiene conto della variabilità del segnale calcico indotto dal potenziale d'azione tra neuroni diversi, al fine di evitare un elevato numero di rilevamenti falsi positivi.

La distribuzione congiunta dell'ampiezza e della costante di decadimento del transiente calcio evocato da un singolo potenziale d'azione viene registrata in un insieme separato di esperimenti, effettuati sullo stesso tipo di neuroni e nelle stesse condizioni sperimentali. Per tenere conto delle lente variazioni della linea di base e ridurre i costi computazionali della deconvoluzione, registrazioni più lunghe vengono suddivise in tracce più brevi della durata da uno a cinque secondi per ciascun neurone in ogni registrazione; l'algoritmo di deconvoluzione può testare un elevato numero di modelli, fino a 1 milione o più. Per accelerare la deconvoluzione, un singolo esperimento viene deconvoluto su fino a 10 computer diversi in parallelo.

Dopo la deconvoluzione, i dati relativi agli eventi di picco vengono analizzati e ispezionati. La probabilità di picco nell'istogramma del tempo peri-stimolo e la frequenza di scarica del neurone vengono calcolate in maniera automatizzata. Di seguito sono riportati esempi di un segnale fluorescente registrato a un tasso di eccitazione molto basso e un altro a un tasso di eccitazione molto alto all'interno della finestra di rilevamento.

Si noti che ogni esempio mostra la risposta a un singolo potenziale d'azione. Qui è mostrata una microfotografia di una sezione cerebrale acuta e di due pipette di stimolazione posizionate nella stessa colonna corticale. Nel quarto strato, queste mostrano le risposte neurali a stimoli ripetuti, e questo grafico illustra l'informazione mutua di Shannon trasmessa dalla popolazione di neuroni registrata.

Di seguito è riportata la misurazione della propagazione dell'attività di spiking sopra soglia tra diverse popolazioni di neuroni corticali. Si tratta degli spike rilevati nei neuroni corticali in risposta a stimolazione elettrica delle fibre talamo-corticali. Quando si registra l'attività neuronale mediante scansione ad accesso casuale, è molto importante registrare all'interno della finestra di rilevamento.

In caso contrario, è molto facile ottenere set di dati inutilizzabili. Il rilevamento ottico dei potenziali d'azione è ancora in una fase iniziale. C'è ampio margine di miglioramento.

Con alcuni miglioramenti, registriamo da un numero ancora maggiore di neuroni. Con ulteriori miglioramenti, saremo addirittura in grado di effettuare registrazioni in animali svegli e in attività comportamentale.