Cella di misura singola di rilascio di dopamina con simultanea di tensione-clamp e Amperometria
21 novembre 2012
La tecnica di misura amperometrico il rilascio di dopamina da una singola cellula rilevando la corrente ossidativo prodotta per ossidazione spontanea dopamina. Morsetto di tensione simultanea e la metodologia amperometria rivelano il rapporto meccanicistico tra il generale "attività" del trasportatore della dopamina e il ruolo di regolamentazione di questa attività sul trasporto inverso di dopamina.
Lo scopo di questa procedura è misurare il trasporto inverso della dopamina in un neurone bloccato a potenziale costante, utilizzando contemporaneamente la tecnica del patch clamp e la voltammetria per misurare il rilascio di dopamina mediato da DAT. Questo viene ottenuto innanzitutto testando l'integrità dell'elettrodo voltammetrico con la dopamina. Il secondo passaggio consiste nel posizionare l'elettrodo voltammetrico vicino alla cellula e ottenere un'ampia registrazione in modalità whole cell del neurone mediante una pipetta per patch.
Successivamente, la tensione della cellula viene controllata mediante la pipetta per il patch e il rilascio di dopamina mediato dal trasportatore della dopamina (DAT) da parte della cellula viene registrato simultaneamente con un elettrodo piroamperometrico. L'ultimo passaggio consiste nell'aggiungere un inibitore del DAT e registrare nuovamente le correnti della cellula intera e quelle piroamperometriche, in modo da poter sottrarre la corrente specificamente mediata dal trasportatore della dopamina. L'importanza di questa tecnica risiede nella possibilità di misurare il trasporto inverso della dopamina attraverso il trasportatore della dopamina, controllando simultaneamente la tensione del neurone dopaminergico.
Il sistema di registrazione simultanea patch clamp e barometria richiede un microscopio invertito con ottime ottiche DIC e un obiettivo con lunga distanza di lavoro per generare una sorgente luminosa DC per il sistema. Collegare la sorgente luminosa del microscopio a una batteria d'auto per garantire un basso rumore elettrico. I micromanipolatori idraulici vengono utilizzati perché non contribuiscono in modo significativo ai livelli di rumore nella nostra configurazione.
Un manipolatore destro viene utilizzato per il voltage clamp e la registrazione in modalità whole cell, mentre un manipolatore sinistro viene impiegato per la pirometria. Per preparare l'elettrodo per la registrazione in modalità whole cell, tirare una pipetta di quarzo con un puller P 2000. In genere, si utilizza una pipetta con una resistenza compresa tra tre e quattro megaohm.
Successivamente, riempire l'elettrodo con la soluzione per pipetta contenente dopamina ad una concentrazione di un millimolare. Quindi montarlo sul porta-pipetta del manipolatore destro. Accertarsi di avvolgere il contenitore che contiene la soluzione per pipetta con dopamina con della carta d'alluminio e mantenerlo sul ghiaccio quando non è in uso.
Dato che la dopamina è ossidabile, mantenere la soluzione sul ghiaccio e al riparo dalla luce ridurrà la velocità di ossidazione. Infilare il filo d'argento nel porta-elettrodo, quindi avvitare l'adattatore parametrico am sul porta-elettrodo. Successivamente, riempire l'elettrodo tric con una quantità sufficiente di mercurio da far contatto con il filo d'argento.
Quando si monta l'elettrodo sull'adattatore, assicurarsi di ispezionare al microscopio la fibra di carbonio pro CFE a basso rumore e l'elettrodo parametrico per verificare che la punta sia pulita e integra. È necessario tenere l'estremità opposta della fibra di carbonio per proteggerne la punta da eventuali danni. Successivamente, montare l'elettrodo pro CFE Tric.
Successivamente montare l'elettrodo assemblato sul manipolatore idraulico sinistro per esaminare l'integrità dell'elettrodo tric. Abbassarlo in una piastra di Petri con fondo di vetro contenente la soluzione esterna. Registrare la corrente di base in assenza di dopamina.
Quindi aggiungere 10 microlitri di una soluzione di dopamina uno millimolare alla piastra. Un buon elettrodo amperometrico dovrebbe registrare un aumento della corrente ossidativa. Assicurarsi di verificare l'integrità dell'elettrodo amperometrico prima e dopo gli esperimenti.
In questa procedura, recuperare i neuroni dopaminergici o le cellule ingegnerizzate per esprimere il trasportatore della dopamina, posizionati nella piastra di Petri con fondo in vetro, dall'incubatore. Lavare delicatamente le cellule o i neuroni dopaminergici tre volte con soluzione esterna calda. Per visualizzare le cellule ed eseguire l'esperimento, montare la piastra di Petri con fondo in vetro sul supporto del microscopio e individuare il punto focale corretto per osservare chiaramente le cellule.
Successivamente, applicare una pressione positiva all'elettrodo per la registrazione in patch. Utilizzando una siringa da un millilitro, abbassare delicatamente entrambi gli elettrodi nella soluzione avvicinandoli alla cellula mediante i micromanipolatori. Quindi posizionare l'elettrodo emper metrico sul lato sinistro della cellula e l'elettrodo per la patch sul lato destro.
Quando l'elettrodo della patch è a contatto con la cellula, applicare una leggera aspirazione tramite bocca o siringa per formare un sigillo giga sulla cellula. Successivamente, rompere il sigillo mediante aspirazione per ottenere la configurazione in intera cellula e attendere da cinque a otto minuti affinché avvenga la dialisi della soluzione interna contenente dopamina all'interno della cellula.
Successivamente, registrare le correnti mediate da DAT applicando uno step di tensione della membrana cellulare tra -60 e +100 millivolt a partire da un potenziale di mantenimento di -40 millivolt attraverso la pipetta. Per determinare il flusso specifico di dopamina mediato da DAT, registrare le correnti emperometriche in assenza e in presenza di un antagonista di DAT. La corrente tric specifica mediata da DAT viene quindi determinata sottraendo le tracce registrate in presenza dell'antagonista di DAT dalle tracce emperometriche registrate in assenza dell'antagonista.
Una deflessione verso l'alto nelle correnti tric corrisponde a un flusso esterno di dopamina mostrato qui. Correnti mediate da DAT registrate aumentando la tensione di membrana di 20 millivolt tra -60 e +100 millivolt a partire da un potenziale di mantenimento di -40 millivolt, con la pipetta contenente dopamina 2 millimolare, in modalità di whole cell patch. Qui è mostrata la corrente emperometrica acquisita simultaneamente alla corrente in whole cell.
Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare il trasporto inverso della dopamina tramite il trasportatore della dopamina in un neurone con clampaggio del voltaggio. Ricorda di verificare l'integrità dell'elettrodo parametrico prima e dopo gli esperimenti, e non dimenticare di sottrarre le tracce registrate in presenza dell'antagonista dalle tracce registrate in assenza dell'antagonista.
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Panoramica
In questo articolo viene descritta una tecnica per misurare il trasporto inverso della dopamina nei neuroni mediante l'uso combinato di patch clamp e pirometria. Il metodo consente di valutare il rilascio mediato dal trasportatore della dopamina (DAT) controllando al contempo la tensione del neurone.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Elettrofisiologia
- Dinamica dei neurotrasmettitori
Sfondo
- La dopamina è un neurotrasmettitore fondamentale coinvolto in numerose funzioni cerebrali.
- Il trasportatore della dopamina svolge un ruolo chiave nella regolazione dei livelli di dopamina.
- Comprendere i meccanismi di trasporto inverso è essenziale per ottenere informazioni sui segnali dopaminergici.
- Questa tecnica combina il blocco del potenziale con misurazioni amperometriche per un'elevata precisione.
Scopo dello studio
- Misurare il trasporto inverso della dopamina in neuroni bloccati in tensione.
- Studiare la relazione tra l'attività del trasportatore della dopamina (DAT) e il rilascio di dopamina.
- Fornire un metodo per lo studio della funzione dei neuroni dopaminergici in tempo reale.
Metodi Utilizzati
- Verifica dell'integrità dell'elettrodo voltammetrico mediante dopamina.
- Stabilimento della configurazione whole cell sulla neurona mediante una pipetta per patch.
- Controllo del potenziale cellulare mediante la pipetta per patch.
- Registrazione del rilascio di dopamina mediato da DAT mediante l'elettrodo voltammetrico.
Risultati principali
- Misurazione riuscita del rilascio di dopamina durante il voltage clamping.
- Dimostrato l'effetto degli inibitori del trasportatore della dopamina (DAT) sul trasporto della dopamina.
- Fornito informazioni sui meccanismi regolatori del trasporto della dopamina.
- Convalidato il metodo per lo studio della dinamica neuronale della dopamina.
Conclusioni
- La tecnica misura efficacemente il trasporto inverso della dopamina.
- Il controllo simultaneo della tensione migliora la comprensione della funzione del trasportatore della dopamina (DAT).
- Questo metodo può essere applicato a ulteriori studi sul segnale dopaminergico.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente la misurazione diretta del rilascio di dopamina tramite il trasportatore della dopamina sotto controllo di tensione, fornendo informazioni meccanicistiche sulla funzione del trasportatore rilevanti per la scoperta di farmaci neuropsichiatrici. Isolando in tempo reale il rilascio mediato da DAT, supporta la validazione del bersaglio e riduce i rischi associati alle ipotesi riguardo la segnalazione dopaminergica nei modelli di malattia. L'approccio migliora l'affidabilità predittiva nella fase iniziale della scoperta, collegando l'attività del trasportatore alla dinamica dei neurotrasmettitori.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Indaga il meccanismo di efflusso del trasportatore della dopamina per validare l'interazione funzionale con il bersaglio in neuroni vivi.
- Valore operativo: Consente la registrazione simultanea elettrofisiologica e amperometrica per correlare il potenziale di membrana al flusso di dopamina mediato dal trasportatore.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative del corrente ossidativo risolte nel tempo che riflettono il rilascio di dopamina dipendente da DAT sotto gradini di tensione controllati.
- Valore operativo: Stabilisce un formato di saggio riproducibile per misurare l'efflusso mediato da trasportatori, supportando lo screening di composti modulatori del DAT.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega l'attività di efflusso del trasportatore della dopamina (DAT) all'omeostasi extracellulare della dopamina, fornendo informazioni per modelli di malattia in cui è implicata una disfunzione del trasportatore.
- Valore operativo: Fornisce un sistema rilevante per le malattie per valutare perturbazioni genetiche o farmacologiche della funzione del trasportatore della dopamina.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta, consentendo la riduzione del rischio meccanicistico dei bersagli del trasportatore della dopamina prima degli sforzi di identificazione del capostazione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui meccanismi di inversione del trasportatore e la chiarificazione dei percorsi nei neuroni dopaminergici.
- Screening: Fornisce output quantitativi pronti per saggi per valutare gli effetti dei composti sull'efflusso mediato da DAT.
- Analisi: Consente misurazioni simultanee della corrente a livello di intera cellula e di tipo amperometrico per isolare segnali specifici del DAT mediante sottrazione farmacologica.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica modellando la disregolazione della dopamina in sistemi neuronali con controllo del potenziale.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per valutare la funzione del trasportatore in diversi modelli neuronali o contesti patologici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora la fiducia nella validazione dell'obiettivo misurando direttamente il rilascio di dopamina mediato dall'efflusso sotto controllo fisiologico della tensione.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione dei saggi attraverso la sincronizzazione tra patch clamp e amperometria, riducendo la variabilità nelle misurazioni del flusso di neurotrasmettitore.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti chiarificando il meccanismo d'azione del trasportatore, riducendo l'abbandono tardivo dei composti dovuto a incomprensioni meccanicistiche.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione di composti mirati al DAT in base a dati funzionali sulla modulazione dell'efflusso, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in elettrofisiologia, amperometria e coltura neuronale per mantenere l'integrità dell'elettrodo e la fedeltà del segnale.
- Si basa su strumentazione a basso rumore, inclusi manipolatori idraulici, amplificatori doppi Axopatch 200B ed elettrodi in fibra di carbonio per la registrazione simultanea.
- Necessita di una standardizzazione intersettoriale dei protocolli di tensione e dei metodi di sottrazione con antagonisti per garantire la comparabilità tra esperimenti.
- Comporta considerazioni di adattamento per diversi modelli neuronali, in particolare per quanto riguarda i livelli di espressione del trasportatore della dopamina e lo stato di salute della membrana.
- Include limitazioni pratiche come l'ossidazione della soluzione di dopamina, che richiede un'adeguata manipolazione e la validazione della linea di base prima e dopo gli esperimenti.
