C. elegans Monitoraggio e valutazione del comportamento

Fenotipizzazione. La locomozione di sea elegance è uno strumento importante nella scoperta di geni e neuroni coinvolti nel comportamento di sea elegance. Sea elegance esegue comportamenti locomotori stereotipati, come movimenti in avanti e all'indietro e vari tipi di svolte, modificando la propria forma. Per quantificare questi movimenti su lunghe distanze e con elevata risoluzione spaziale e temporale, abbiamo realizzato un sistema di tracciamento dei vermi per catturare il movimento di sea elegance mentre si muove sulla superficie di una piastra in agar.

Abbiamo inoltre sviluppato un software per isolare e analizzare quantitativamente questi movimenti mediante programmi personalizzati scritti in LabVIEW e MATLAB. Una sfida comune a tutti i sistemi di video tracciamento è che generano una quantità enorme di dati altamente multidimensionali. Il nostro programma di elaborazione delle immagini e analisi dei dati affronta questa sfida riducendo le forme del verme in un insieme di componenti indipendenti, ricostruendo in modo esaustivo il comportamento del verme in funzione di soli tre o quattro parametri.

Una piastra di agar viene illuminata da una sorgente luminosa a fibra e ripresa con una fotocamera. Questo sistema è montato su un piano di traslazione XY. Il piano viene spostato mediante motori passo standard, collegati a un controllore per motori passo.

Il controller e la telecamera sono collegati al computer e controllati da programmi personalizzati scritti in LabVIEW. La telecamera acquisisce l'immagine della superficie di una piastra di agar e identifica oggetti scuri su uno sfondo chiaro. Un segno di calibrazione per il processo di calibrazione automatica viene effettuato pungendo la superficie dell'agar.

Con una pinza per vermi, la qualità dell'immagine viene regolata in modo che il programma informatico possa quantificare gli oggetti in tempo reale. Il guadagno, la luminosità e la velocità dell'otturatore della fotocamera possono essere regolati per ottenere un oggetto scuro su uno sfondo chiaro. È possibile verificare l'immagine binaria filtrata, che viene utilizzata dal programma di tracciamento.

Il software dispone di una funzione di auto-calibrazione che calcola la matrice di calibrazione spostando un oggetto di prova su una distanza fissa. La distanza in pixel viene calibrata rispetto ai passi compiuti dal motore passo-passo mediante la matrice di calibrazione.

Dopo la calibrazione, il sistema è pronto all'uso e non necessita di essere ricalibrato a meno che non venga modificata l'ingrandimento o riposizionata la fotocamera. Un anello di rame verrà utilizzato per contenere i vermi ed evitare che migrino verso il bordo della piastra. Riscaldare innanzitutto l'anello ponendolo su un blocco riscaldante o su un dispositivo equivalente.

L'anello deve essere riscaldato per circa un minuto. Posizionare l'anello su una nuova piastra di agar e premere leggermente per fissarlo alla superficie dell'agar. Una piastra di agar contenente tampone NGM verrà utilizzata per lavare via i residui di cibo dai vermi allo stadio L4 e adulti giovani.

Dopo aver trasferito i vermi nel tampone NGM, lasciarli nuotare per alcuni minuti. Posizionare con attenzione uno dei vermi lavati sulla piastra di tracciamento vicino al centro dell'anello. Questa piastra verrà successivamente utilizzata per il tracciamento del verme.

Posizionare la piastra preparata sullo stage del worm tracker. Eseguire il programma LabVIEW e selezionare le opzioni desiderate, come la posizione delle immagini, i tipi di immagini, le misurazioni e le impostazioni della telecamera. Utilizzando il joystick, spostare il microscopio finché un'immagine del verme appare nel campo visivo sullo schermo del computer.

Quindi premere traccia per attivare il programma di tracciamento. Qui mostriamo un verme tracciato in tempo reale. Il programma informatico misura i movimenti di immagini filtrate in bianco e nero come mostrato e può effettuare misurazioni su questa immagine in tempo reale.

Dopo il tracciamento, è possibile ricostruire una traiettoria globale a partire dai movimenti del motore passo-passo, mentre i cambiamenti locali della forma del verme possono essere osservati in dettaglio. I vermi si muovono producendo movimenti ondulatori. Catturiamo questi movimenti scheletonizzando il verme in una singola curva centrale, e successivamente descrivendo tale curva come un insieme di angoli.

Successivamente decomponiamo gli scheletri nelle loro forme fondamentali, altrimenti note come autovettori. Mediante queste autofunzioni, possiamo ricostruire le forme del verme e quantificare i suoi movimenti. Utilizzando i primi due modi, possiamo specificamente catturare la posizione di fase del ciclo ondulatorio del verme, come mostrato nel secondo pannello.

Il primo pannello mostra la distribuzione congiunta delle modalità uno e due, evidenziando un ciclo limite circolare. Il movimento di fase in una direzione corrisponde a un movimento in avanti, mentre il movimento di fase nell'altra direzione corrisponde a un movimento all'indietro. Pertanto, la velocità di fase corrisponde alla velocità del verme.

Nello spazio reale, la forte correlazione tra la fase e la velocità nel mondo reale è visibile nell'ultimo pannello. Utilizzando la velocità di fase derivata dalla modalità propria, possiamo rivelare alcuni dettagli sottili del comportamento di eleganza marina che verrebbero trascurati a occhio nudo. Ad esempio, la distribuzione congiunta della velocità di fase e della fase indica chiaramente che i vermi abbandonano e assumono lo stato di avanzamento preferenzialmente a fasi specifiche del movimento.

Qui abbiamo dimostrato un sistema di tracciamento facile da usare che registra immagini dettagliate del comportamento dei silicons mentre si muovono sulla superficie e sulle piastre ACA. La quantità di informazioni contenute in queste immagini è vasta e altamente multidimensionale, e pertanto abbiamo anche creato un metodo per ridurre la dimensionalità dei dati in quattro misure fondamentali. Queste misure sono facili da interpretare in relazione al comportamento del verme.

Questo lavoro è stato sviluppato per misurare il comportamento dei vermi in presenza di modifiche minime, e il sistema può essere utilizzato anche per misurare l'attività neuronale mediante regioni marcate geneticamente e rivestite. L'intero sistema è flessibile nella progettazione e può essere impiegato con altri sistemi di strisciamento come Doof law, LOEs.