High Throughput singola cellula e cellula Multiple-Micro-incapsulamento
15 giugno 2012
Combinando goccia generazione monodisperse con ordinamento inerziale di cellule e particelle, si descrive un metodo per incapsulare un numero desiderato di celle o particelle in una singola goccia a tassi kHz. Abbiamo dimostrato efficienze due volte superiori a quelli di incapsulamento non ordinate per raccogliere le gocce singola e doppia-particelle.
Le applicazioni che utilizzano cellule incapsulate in gocce di dimensioni picolitro sono state spesso limitate dall'impossibilità di controllare il numero di cellule per goccia. Questo protocollo illustra un metodo per controllare l'incapsulamento cellulare combinando due fenomeni microfluidici distinti: l'ordinamento idrodinamico delle cellule e la generazione di gocce in una microugello a focalizzazione del flusso. In un canale a monte, viene fornita una portata sufficientemente elevata di soluzione acquosa contenente cellule o particelle sospese, in modo da indurre la formazione di treni di cellule con spaziatura uniforme nella direzione del flusso a valle.
Viene utilizzato un ugello per la generazione di gocce a focalizzazione del flusso per formare gocce acquose a frequenze dell'ordine del chilohertz in un fluido oleoso stabilizzato da un tensioattivo. Successivamente, i treni ordinati di cellule o particelle vengono combinati con la generazione delle gocce regolando le portate dei flussi acquoso e oleoso in modo da ottenere una frequenza di generazione delle gocce sincronizzata con l'arrivo di cellule o particelle disposte longitudinalmente all'ugello di generazione delle gocce, utilizzando le particelle come surrogati delle cellule. Per dimostrare questo protocollo, le portate devono essere sufficientemente ridotte da limitare il flusso del fluido.
Le sollecitazioni di taglio sulle cellule biologiche, la sovrapposizione dell'ordinamento cellulare, la generazione di goccioline e la vitalità cellulare. I vincoli relativi alla portata del flusso acquoso forniscono un regime operativo ideale per l'incapsulamento controllato di singole cellule o di più cellule. L'analisi dei dati di microscopia video mostra che le efficienze di incapsulamento sia di singole che di doppie cellule o particelle superano quelle di incapsulamento casuale e riducono notevolmente il numero di goccioline che non contengono il numero desiderato di cellule o particelle.
Il confinamento di cellule e gocce limita la diluizione delle secrezioni cellulari, evidenzia l'eterogeneità cellulare e controlla anche i segnali intercellulari rispetto a una sospensione in massa. Un metodo efficiente per incapsulare queste cellule all'interno di gocce fornisce uno strumento prezioso per i ricercatori biologici. Per iniziare questa procedura, progettare un modello di microcanale come mostrato in questa figura utilizzando il software AutoCAD.
La sezione del canale lungo rappresenta il canale di flusso acquoso di ordinamento con una larghezza di 27 micrometri. Lo schema ingrandito dell'ugello mostra larghezze di canale uguali di 27 micrometri per il canale di ordinamento acquoso e il canale oleoso, seguite dalla contrazione dell'ugello di 22 micrometri e da un'espansione improvvisa verso un canale più largo di 61 micrometri. L'altezza del dispositivo è di 52 micrometri.
Sia l'ingresso dell'acqua che quello dell'olio sono dotati di filtri antidepositi di grandi dimensioni con aperture dell'ordine della larghezza del canale di ordinamento, come illustrato da questo schema ingrandito dell'ingresso dell'olio. Mostrata è un'immagine reale del canale di ordinamento e dell'ugello, iniettati con un colorante. Ricorrere a un produttore esterno per la stampa di una maschera di trasparenza ad alta risoluzione su film di Mylar o su quarzo, in cui i canali risultano trasparenti su uno sfondo scuro.
Successivamente, creare un master in silicio e fotoresist SU-8 per la stampatura per replica. Fissare con nastro il modello master sul fondo di una piastra di Petri per la replica in PDMS. Al termine della stampatura per replica e dopo aver ritagliato il contorno del dispositivo, utilizzare un punch per biopsia con diametro esterno di 0,75 millimetri per creare i porti fluidici nelle tre aree rotonde mostrate in questa figura. Applicare un nastro adesivo trasparente sul lato del PDMS con il pattern e staccarlo per rimuovere eventuali polveri dopo il legame al plasma.
Il PDMS su un vetrino microscopico di vetro pulito. Posizionare l'intero dispositivo in un forno e riscaldare gradualmente il forno fino a 120 gradi Celsius. Lasciare il dispositivo nel forno a 120 gradi Celsius per tutta la notte per completare l'adesione e per riportare il PDMS al suo stato idrofobico originale.
Un metodo alternativo per rendere idrofobica la superficie in vetro del canale consiste nell'iniettare un rivestimento come aquae nei porti fluidici e successivamente spurgare con aria. Utilizzando una siringa da un millilitro e un ago da siringa, aspirare alcune centinaia di microlitri di aria, seguiti da una piccola quantità di aquil sufficiente a riempire soltanto la punta metallica della siringa. Iniettare con cura, ma con fermezza, l'aqua seguita dall'aria di spurgo nei porti fluidici, senza rompere in modo aggressivo il legame tra PDMS e vetro.
Ripetere la spurgo d'aria su tutte le porte di ingresso e di uscita, asciugando eventuali eccessi di acqua per evitare depositi che potrebbero ostruire i canali durante l'essiccazione. Controllare la concentrazione cellulare è essenziale per ottenere il numero corretto di cellule per il numero corretto di gocce. Questo processo presenta due aspetti complessi.
Il primo passaggio consiste nel stimare correttamente la concentrazione in anticipo, e il secondo nel mantenere tale concentrazione durante l'esperimento. Per il dispositivo specifico utilizzato in questo studio, cellule o particelle di otto-quindici micron dovrebbero essere adeguatamente ordinate per un'incapsulamento controllato. In questa dimostrazione, verranno utilizzate microsfere polisolfoniche da 9,9 micron come surrogati cellulari per preparare la concentrazione della sospensione acquosa di particelle al fine di ottenere un incapsulamento ottimale. Si parte da una concentrazione iniziale di microsfere pari all'1% in peso di solidi, basandosi su dati precedenti per un ordinamento completo. A titolo orientativo, aumentare la concentrazione fino all'1,5% in peso di solidi centrifugando delicatamente un millilitro del campione iniziale, rimuovendo 250 microlitri del liquido soprannatante e risospendendo le particelle mediante vortex o un mescolamento più delicato.
Quando si utilizzano cellule, sia le cellule che le particelle di polistirene hanno una densità specifica maggiore di uno, anche se non mostrata in questo video. Per esperimenti a lungo termine della durata di molti minuti fino a ore, la soluzione può essere bilanciata in termini di galleggiamento aggiungendo un soluto come cloruro di calcio per le particelle o OptiPrep per le cellule. Una volta pronta la sospensione di cellule o particelle, preparare un campione da 10 millilitri della fase continua di olio fluorocarbonico in un tubo da centrifuga da 15 millilitri utilizzando un vorticoso.
Mescolare il tensioattivo e l'olio fluorocarbonico fino a raggiungere circa il 2,5% in peso. In questo caso otteniamo una miscela al 2,4% in peso, che è accettabile per impostare l'esperimento di microincapsulamento. Prima di tutto, accendere l'alimentazione del microscopio ottico invertito e della telecamera ad alta velocità.
Concentrarsi sullo strato del microcanale ed esaminare i canali alla ricerca di ostruzioni e di eventuali detriti che potrebbero staccarsi. Selezionare un canale privo di detriti di grandi dimensioni o di ostruzioni evidenti. Tagliare tre spezzoni di tubo in PVC traslucido tigon per l'ingresso della fase acquosa, l'ingresso dell'olio e l'uscita dell'emulsione, al fine di ridurre al minimo il volume morto.
Tagliare un tratto di tubo sufficiente a raggiungere dalla pompa a siringa al microscopio. Tagliare le estremità dei tubi con un angolo di 45 gradi per facilitarne l'inserimento nei porti fluidici; utilizzare pinzette per inserire a pressione le estremità dei tubi nei porti fluidici. Successivamente, inserire a pressione un ago da siringa in acciaio inossidabile con punta smussata calibro 30 nell'estremità libera del tubo di ingresso acquoso.
Ripetere per il tubo di ingresso dell'olio. Spostare il dispositivo e collegare il tubo alla piastra del microscopio utilizzando un obiettivo da 20 volte, allineare e mettere a fuoco sull'ugello del dispositivo. Regolare manualmente il microscopio per l'illuminazione Köhler al fine di ottenere un'illuminazione ottimale nel piano focale.
Utilizzando il software della telecamera ad alta velocità, ritagliare l'area di interesse attorno alla bocchetta per consentire frame rate più elevati, quindi impostare il frame rate, il tempo di esposizione e le altre impostazioni della telecamera necessarie per una registrazione ottimale. Successivamente, riempire una siringa da un millilitro con la soluzione della fase acquosa precedentemente preparata e ben miscelata. Riempire una siringa da tre millilitri con la soluzione della fase oleosa.
Tenere verticalmente una delle siringhe riempite e battere leggermente per spostare le bolle d'aria verso l'uscita della siringa. Premere lentamente lo stantuffo per un tempo sufficiente a spingere l'aria fino alla punta della siringa, mantenendo la siringa in posizione verticale. Collegare la siringa all'ago corrispondente già attaccato al dispositivo.
Premere lo stantuffo per forzare l'aria attraverso il volume morto dell'ago della siringa finché il fluido non viene spinto attraverso il tubo quasi fino al dispositivo; fissare saldamente la siringa a una pompa per siringhe e inserire il blocco dello stantuffo. Ripetere le connessioni per la seconda siringa e montarla su una seconda pompa per siringhe. Accendere ciascuna pompa per siringhe e programmare ciascuna pompa. Utilizzando i protocolli del produttore, impostare le portate iniziali a 50 microlitri al minuto per la fase oleosa e a 5 microlitri al minuto.
Per l'avvio della fase acquosa, le pompe attendono che ciascun fluido entri nel dispositivo e riempia i canali, espellendo l'aria residua. Ciò può richiedere diversi minuti utilizzando le portate iniziali. Osservare la formazione delle gocce all'ugello.
Aumentare lentamente la portata del flusso acquoso per osservare l'ordinamento delle particelle nel lungo canale della soluzione acquosa. Durante l'aumento della portata, evitare di innalzarla fino al punto in cui si verifica l'effetto di jetting del flusso di fluido acquoso all'ugello, come mostrato in questo esempio, utilizzando un ugello diverso per la generazione di gocce; qui, il flusso instabile e le gocce inconsistenti sono evidenti. Se la concentrazione delle particelle è troppo bassa per produrre treni alternati con un numero relativamente ridotto di particelle mancanti e il campione non è stato bilanciato per galleggiamento, inclinare fisicamente la pompa per siringa verso l'uscita della siringa per favorire un graduale deposito delle particelle verso le uscite della siringa.
Una volta raggiunto un adeguato ordinamento, regolare la portata dell'olio per regolare la frequenza di generazione e le dimensioni delle gocce. Regolare iterativamente entrambe le portate per ottenere le velocità di incapsulamento e i volumi delle gocce desiderati. Una volta confermato un incapsulamento ordinato stabile, spostare il tubo di uscita dal serbatoio di scarto a un serbatoio di raccolta per un uso futuro.
È possibile ottenere un'incapsulazione singola o doppia di particelle o cellule con elevata efficienza. L'utilizzo di questo protocollo qui mostrato produce un risultato rappresentativo di incapsulazione singola con una portata del flusso oleoso di 60 microlitri al minuto e una portata del flusso acquoso di nove microlitri al minuto. Lambda, il numero medio di particelle per goccia, è 0,95.
La distanza tra le particelle nella direzione del flusso è di circa 17-18 micron per particelle alternate completamente ordinate. La frequenza di generazione delle goccioline in questo esempio è di 6,1 kHz con una dimensione media delle goccioline di 24,4 picolitri. L'istogramma confronta l'efficienza di incapsulamento delle particelle nelle goccioline in termini di incapsulamento singolo con il segno più.
In statistica, per un campione di 517 gocce, la frazione media di gocce contenenti una singola particella è del 79,5%, rispetto a una frazione prevista di incapsulamento casuale del 36,7%. La frazione di particelle che si ritrova in gocce correttamente incapsulate è stata osservata essere dell'83,7% per un campione di 491 particelle, mentre la frazione di incapsulamento casuale era del 37,3%. L'incapsulamento di due particelle viene ottenuto semplicemente riducendo la portata dell'olio a 30 microlitri al minuto, mantenendo costante la portata acquosa a nove microlitri al minuto. Qui lambda, il numero medio di particelle per goccia, è 1,8. Simile all'incapsulamento di una singola particella.
La distanza tra le particelle nella direzione del flusso è di circa 17-18 micron per particelle alternate completamente ordinate. Le gocce più grandi hanno una dimensione media di 39,8 picolitri e si sono formate a una frequenza di 3,8 kilohertz rispetto all'incapsulamento casuale. Per un campione di 383 gocce, la frazione media di gocce con incapsulamento ordinato contenenti due particelle è del 71,5%, rispetto a una frazione prevista di incapsulamento casuale del 26,8%. La frazione di particelle che si è ritrovata all'interno delle gocce correttamente incapsulate è stata osservata essere del 79,5% per un campione di 689 particelle, mentre la frazione di incapsulamento casuale era del 33,4%.
Nel complesso, questi risultati mostrano che le efficienze di incapsulamento sia di singole che di doppie particelle superano quelle dell'incapsulamento casuale di oltre un fattore due e riducono notevolmente il numero di gocce che non contengono il numero desiderato di cellule o particelle. L'importanza di concentrazioni appropriate di particelle o cellule per un'elevata efficienza di incapsulamento è illustrata in questa serie sperimentale. Sebbene le portate dell'olio e della fase acquosa siano le stesse di quelle utilizzate nella prova di incapsulamento di doppia particella mostrata in precedenza, il numero medio di cellule per goccia lambda è stato ridotto a 1,57.
Di conseguenza, non si verifica un ordinamento completo e pertanto si formano fori nei treni, lasciando gocce con un numero inferiore al previsto di particelle. Questo istogramma mostra la ridotta efficienza dell'incapsulamento di due particelle a causa del valore più basso di Lambda. Per una dimensione del campione di 324 gocce, la frazione media di gocce contenenti due particelle è stata del 55,9%, con un numero quasi uguale di gocce con una singola particella rispetto a quelle con due particelle.
Ciò indica che Lambda dovrebbe essere uguale o vicino al numero di cellule desiderate per goccia al fine di massimizzare le particelle o le cellule correttamente incapsulate, con il valore esatto di lambda scelto in base al fatto che sia tollerabile un numero inferiore o superiore di cellule per goccia. In questa dimostrazione, sfruttiamo le differenze di galleggiamento per consentire un controllo in tempo reale della concentrazione durante l'esperimento. Tuttavia, per esperimenti di durata maggiore, potrebbe essere consigliabile bilanciare il galleggiamento per ottenere risultati più costanti dopo l'incapsulamento delle cellule in gocce acquose.
È possibile eseguire esperimenti dipendenti dal tempo in una provetta da centrifuga o al microscopio reiniettando le gocce in array microfluidici.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per controllare l'incapsulamento di cellule in gocce di dimensioni picolitriche combinando l'ordinamento idrodinamico delle cellule con la generazione di gocce. L'approccio consente una generazione ad alta frequenza di gocce mantenendo al contempo il controllo sul numero di cellule per goccia.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microfluidica
- Incapsulamento cellulare
- Tecniche di generazione di gocce
Sfondo
- L'incapsulamento di cellule in gocce piccole è fondamentale per diverse applicazioni.
- I metodi precedenti non permettevano un controllo sul numero di cellule per goccia.
- Le tecniche microfluidiche possono aumentare la precisione dell'incapsulamento cellulare.
- La combinazione di diversi fenomeni microfluidici può migliorare l'efficienza.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per il controllo preciso dell'incapsulamento cellulare in gocce.
- Dimostrare l'efficacia della combinazione tra ordinamento cellulare e generazione di gocce.
- Raggiungere efficienze di incapsulamento superiori rispetto ai metodi non ordinati.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di una bocchetta per la generazione di gocce a flusso focalizzato.
- Alti tassi di flusso per creare treni ordinati di cellule o particelle.
- Sincronizzazione della generazione di gocce con l'arrivo di cellule ordinate.
- Uso di un fluido di trasporto oleoso stabilizzato con surfattante per la formazione delle gocce.
Risultati principali
- Controllo dimostrato sul numero di cellule per goccia.
- Raggiunti tassi di generazione di gocce a frequenze chilohertz.
- Efficacia superiore rispetto all'incapsulamento non ordinato.
- Validazione del metodo mediante l'uso di cellule e particelle surrogate.
Conclusioni
- Il metodo consente un'efficiente incapsulamento delle cellule in goccioline microfluidiche.
- La combinazione dell'ordinamento cellulare con la generazione di goccioline migliora il controllo.
- Questo approccio può essere applicato a diverse applicazioni biologiche e biomediche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il controllo del numero di cellule per goccia nell'incapsulamento microfluidico affronta una limitazione fondamentale nell'analisi ad alto rendimento e nell'analisi di singola cellula, in cui l'incapsulamento casuale porta a un uso inefficiente dei campioni e a un aumento del successivo ordinamento. Sincronizzando la generazione delle gocce con treni ordinati di cellule, questo metodo migliora significativamente l'efficienza di incapsulamento per numeri definiti di cellule, aumentando la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi e nella riduzione del rischio meccanicistico. L'approccio supporta flussi di lavoro scalabili e riproducibili per la scoperta precoce e lo sviluppo di saggi, riducendo la variabilità biologica e migliorando la qualità dei dati nelle campagne di screening di composti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche isolando un numero definito di cellule per studiare interazioni omotipiche e eterotipiche in microambienti controllati.
- Valore operativo: Aumenta la frazione di gocce contenenti il numero desiderato di cellule, riducendo gli sprechi e migliorando la produttività nelle applicazioni di screening.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Fornisce gocce monodisperse confinate in cellule che prevengono la diluizione dei biomarcatori e amplificano i segnali derivanti dalle secrezioni cellulari, migliorando la sensibilità del saggio.
- Valore operativo: Consente velocità di generazione delle gocce nell'ordine dei chilohertz con elevata efficienza di incapsulamento, permettendo formati di saggio scalabili e riproducibili per lo screening ad alto contenuto informativo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita lo studio della segnalazione intercellulare e dell'eterogeneità cellulare in gruppi di dimensioni definite, supportando la riduzione meccanicistica dei rischi associati ai candidati principali.
- Valore operativo: Permette la riconfluenza delle gocce per analisi a valle, consentendo una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica senza contaminazioni incrociate.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel processo di scoperta consentendo un'incapsulazione controllata nella fase di preparazione del saggio, supportando l'identificazione dei composti attivi grazie a un migliore rapporto segnale-rumore nelle risposte cellulari e riducendo i falsi negativi derivanti da un carico cellulare non uniforme.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi consentendo un controllo preciso sulla composizione cellulare in ogni goccia, riducendo il rumore derivante da numeri variabili di cellule.
- Screening: Fornisce gocce standardizzate pronte per il saggio con output quantitativi che migliorano la riproducibilità tra diverse esecuzioni e sedi.
- Analisi: Genera metriche di efficienza dell'incapsulamento (Pk=1, Pk=2) che consentono ai team di confrontare l'incapsulamento ordinato rispetto a quello casuale e di valutare le prestazioni del flusso di lavoro.
- Ricerca traslazionale: Permette lo studio di interazioni cellulari controllate, supportando l'allineamento dei biomarcatori e la continuità preclinica per terapie immunomodulanti o dipendenti da co-coltura.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una capacità microfluidica modulare adattabile a diversi tipi cellulari e surrogati di particelle, sostenendo investimenti a livello di piattaforma anziché tecniche monouso.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica derivante dall'eterogeneità cellulare non controllata.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante la generazione sincronizzata di gocce e l'ordinamento cellulare, riducendo la variabilità tra diversi lotti.
- Valore strategico: Decisioni più accurate su prosegui/non prosegui grazie a una qualità superiore dei dati e a una riduzione dei falsi positivi nelle cascade di screening.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per il rischio, consentendo una valutazione più affidabile degli effetti dei composti in contesti cellulari fisiologicamente rilevanti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella progettazione di microfluidica, nell'ottimizzazione della portata e nel controllo della concentrazione delle particelle per mantenere treni ordinati.
- È fortemente dipendente da strumentazione precisa, inclusi pompe a siringa, sistemi di imaging ad alta velocità e ugelli a focalizzazione del flusso con geometrie specifiche.
- Necessita di standardizzazione tra gruppi diversi per quanto riguarda i protocolli di concentrazione di particelle/cellule e l'abbinamento della galleggiabilità in esperimenti a lungo termine.
- Comporta considerazioni di adattamento tra diversi sistemi modello, in particolare per quanto riguarda la sensibilità allo sforzo di taglio e la vitalità cellulare in condizioni di elevate portate.
- I limiti pratici includono la necessità di bilanciare le portate per ottenere un ordinamento ottimale evitando al contempo la formazione di getti, nonché la dipendenza da una concentrazione costante delle particelle per un'efficienza ottimale di incapsulamento.
