Misurazione quantitativa della Invadopodia-mediata proteolisi della matrice extracellulare in singoli contesti e pluricellulari

Questa tecnica standard produce coprioggetti rivestiti di gelatina marcati fluorescentemente, adatti per saggi quantitativi di degradazione della matrice da parte degli invadopodi. Dopo aver etichettato i coprioggetti con gelatina fluorescente, si seminano le cellule e si coltivano per indurre la degradazione della matrice. Successivamente, si fissano e si colorano fluorescentemente le cellule per le proteine marcatori degli invadopodi, si acquisiscono le immagini e si quantifica la degradazione della matrice.

I risultati tipici possono quantificare le differenze nella degradazione della matrice mediata dagli inve podia tra cellule con manipolazione differenziale di geni selezionati o trattate con agenti farmacologici. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la preparazione di coprioggetti rivestiti di gelatina con fluorescenza omogenea è difficile da ottenere a causa di un rivestimento irregolare della gelatina fluorescente o di un maneggio improprio dei coprioggetti rivestiti di gelatina. Il procedimento sarà illustrato dall'assistente professore di ricerca Karen Martin, dall'associata postdottorato Mandy Ammer e dagli studenti universitari Elise Walk, Karen Hayes e Steve Markwell.

Per preparare la soluzione stock di gelatina saccarosio al 5% non marcata, mescolare la gelatina e il saccarosio in PBS e sciogliere completamente a 37 gradi Celsius. Successivamente, conservare a quattro gradi Celsius. Procedere quindi con la pulizia dei coprioggetti di vetro.

Distribuire un singolo cover slip in ciascun pozzetto di una piastra in plastica per colture cellulari a 24 pozzetti, aggiungendo 500 microlitri di acido nitrico al 20% in ogni pozzetto e incubare per 30 minuti. Dopo la rimozione della soluzione di acido nitrico, lavare i cover slip tre volte con acqua deionizzata. Successivamente rivestire.

Ogni coprislip viene trattato con 500 microlitri di poliolina a 50 microgrammi per millilitro, l-lisina, e incubato per 20 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione di polilisina e lavare tre volte con PBS. Il rivestimento con polilisina favorisce un'adesione uniforme e il legame del gelatina marcata sovrastante. Posizionare le piastre a 24 pozzetti sul ghiaccio e aggiungere 500 microlitri di glutaraldeide allo 0,5% appena preparata a ciascun pozzetto.

Incubare bene le piastre sul ghiaccio per 15 minuti. Eseguire tre lavaggi con PBS freddo, quindi aspirare ogni traccia di PBS prima del rivestimento con gelatina. Nel frattempo, durante l'incubazione con glutaraldeide, ricostituire la gelatina coniugata con Oregon Green 488.

Secondo il protocollo del produttore, riscaldare a 37 gradi Celsius la soluzione stock di saccarosio e gelatina al 5% non marcata e la gelatina marcata. Successivamente, diluire 500 microlitri di gelatina marcata in quattro millilitri di gelatina non marcata. Pipettare 100 microlitri della miscela diluita di gelatina 488 su ciascun coprioggetto.

Utilizzare una quantità sufficiente di gelatina per ricoprire il vetrino senza spalmare manualmente. È importante mantenere la miscela diluita di gelatina 488 a 37 gradi durante la procedura di rivestimento per evitare una solidificazione prematura. Inoltre, a partire da questo passaggio, mantenere i vetrini al buio il più possibile per evitare un potenziale sbiancamento fotoindotto.

Dopo aver ricoperto tutti i vetrini in una singola piastra, inclinare la piastra e rimuovere il gelatina in eccesso da ogni pozzetto mediante aspirazione sotto vuoto. Quindi incubare i vetrini ricoperti al buio per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato i vetrini tre volte con PBS, aggiungere 500 microlitri di boroidruro di sodio, boroidruro di sodio.

L'idruro è effervescente e piccole bolle saranno visibili su e intorno a ogni coprislide; incubare per 15 minuti a temperatura ambiente per ridurre e inattivare il glutaraldeide residuo. Rimuovere la soluzione di boroidruro di sodio mediante aspirazione a vuoto con un movimento rapido e circolare lungo il bordo esterno di ciascun pozzetto, facendo attenzione a non aspirare eventuali coprislide staccatesi dal fondo della piastra per coltura tessutale durante il trattamento con boroidruro di sodio. Dopo tre lavaggi con PBS, incubare i coprislide in etanolo al 70% per 30 minuti a temperatura ambiente.

Utilizzando una tecnica sterile, trasferire la piastra contenente il coverslip in un'appaio a flusso laminare di tipo II per colture cellulari di tipo B e risciacquare il coverslip tre volte con PBS sterile mediante ago sterile e pinzette. Trasferire con attenzione i coverslip in una pozzetta vuota di una nuova piastra a 24 pozzetti da equilibrare. I coverslip vanno equilibrati con il mezzo di coltura specifico per il tipo cellulare in esame.

Ora seminare le cellule direttamente sui coverslip dopo un tempo di incubazione appropriato. Processare i campioni per l'immunofluorescenza al fine di montarli. Applicare una goccia di prolungato oro anti-fade o di un reagente simile su un vetrino e posizionare con attenzione il coverslip capovolto, quindi acquisire le immagini per l'analisi.

Questa analisi fornisce l'area normalizzata di degradazione della matrice in rapporto all'area delle cellule o al numero di cellule. È utile per analizzare interi campi microscopici in cui sono presenti molteplici cellule trattate collettivamente con fattori di crescita irna o agenti terapeutici. Per questa analisi, si raccolgono immagini a ingrandimento inferiore, sufficiente per raccogliere in modo efficiente informazioni sulle popolazioni cellulari.

Aprire l'immagine in ImageJ. Verificare le informazioni sulla scala e selezionare le misurazioni. Scegliere l'area e impostare le opzioni di soglia. Calcolare l'area di degradazione utilizzando l'immagine del gelatina fluorescente, correggendo l'illuminazione non uniforme attraverso la sottrazione della soglia di fondo, e impostare i valori di intensità dei pixel superiori e inferiori nell'immagine.

Nelle immagini successive, utilizzare il pulsante impostato nella finestra della soglia per applicare la stessa soglia a tutte le immagini come metodo oggettivo per selezionare l'area di degradazione. Utilizzare la funzione "analizza particelle" per misurare la soglia nelle aree di degradazione della matrice.

Scegliere una dimensione delle particelle maggiore di zero per rimuovere il rumore dalla selezione. Mostrare i contorni per identificare le regioni di interesse. Quindi selezionare visualizza risultati e riepilogo per mostrare le misurazioni, se il disegno ha delimitato specificamente tutte le aree di degrado.

Copiare la misura dell'area totale in un foglio di calcolo; se sono stati selezionati altri oggetti, come detriti, registrare soltanto le aree delle regioni di interesse rilevanti. Successivamente, per calcolare l'area cellulare, aprire la cartella e applicare la soglia all'immagine colorata, impostando i valori di intensità dei pixel superiore e inferiore in modo che i bordi delle cellule vengano selezionati nelle immagini successive. Utilizzare il pulsante "imposta" nella finestra della soglia per applicare la stessa soglia a tutte le immagini.

Come metodo oggettivo per selezionare l'area cellulare. Utilizzare la funzione "analisi delle particelle" per misurare la soglia dell'area delle cellule. Scegliere una dimensione delle particelle maggiore di zero per eliminare il rumore dalla selezione.

Mostra i contorni per identificare le regioni da analizzare, verifica i risultati visualizzati e riassumi per mostrare le misure delle aree. Non selezionare. Includi i fori se sono presenti spazi tra le cellule e un aggregato.

Ora scegliere. Copiare i risultati delle aree per le regioni di interesse rilevanti in un foglio di calcolo e calcolare l'area di degradazione della gelatina per l'area totale delle cellule. Un approccio alternativo consiste nel normalizzare l'area di degradazione al numero di cellule, determinato contando i nuclei colorati con DAP e.

Questo è importante se le manipolazioni alterano l'area media delle cellule. Per questo approccio, utilizzare il plugin per il conteggio dei nuclei per contare automaticamente i nuclei. Regolare le opzioni per ottimizzare i risultati sulle proprie immagini. Se i nuclei si sovrappongono ampiamente, il conteggio automatico potrebbe non fornire un'enumerazione accurata in questo caso.

Il conteggio manuale può essere facilitato mediante l'utilizzo del plugin contatore di cellule se eseguito correttamente. I vetrini coprioggetto sono uniformemente ricoperti di gelatina coniugata con Oregon Green 488. Diversi artefatti possono verificarsi durante la fase di rivestimento e lavorazione dei vetrini coprioggetto rivestiti con gelatina.

Ad esempio, un rivestimento irregolare è causato da una copertura inadeguata del vetrino durante il processo di rivestimento, dovuta a un miscelamento insufficiente, alla stesura manuale o alla solidificazione parziale della miscela di gelatina. I graffi indicano la rimozione della matrice rivestita mediante incisione con aghi o pinze durante la manipolazione. L'essiccazione della superficie del vetrino durante periodi prolungati di conservazione può provocare un aspetto a selciato. Quest'area riflette lo sbiancamento fotoindotto della superficie fluorescente di gelatina durante l'acquisizione delle immagini, causato da un'esposizione prolungata o da una luce ad alta intensità.

Osservare come un'accurata preparazione del vetrino produce una fluorescenza omogenea quando visualizzata al microscopio. Le sottili matrici risultanti ottenute durante questa procedura offrono un metodo sensibile per valutare la capacità delle cellule di degradare la matrice extracellulare (ECM). Ad esempio.

Queste immagini mostrano l'attività di degradazione della matrice del podio invasa da una cellula di cancro orale OSC 19. Le cellule sono state seminate su un'ampolla di gelatina coniugata con Oregon Green 488 e analizzate mediante microscopia fluorescente, come mostrato nelle immagini 2D e 3D. Le cellule OSC 19 seminate su ampolle di gelatina coniugata con Oregon Green 488 sono state marcate con Phalloidina coniugata con R-domina e con anticorpi anti-actina corticale, visualizzati mediante anticorpo secondario ANOR 647 e colorate artificialmente in verde per evidenziare l'invasione.

I podi sono evidenti nell'immagine fusa come concentrazioni focali citoplasmatiche di actina F e cortanina che si sovrappongono alle aree di volume di scavo del gelatina. La visualizzazione mostra come i podi invasivi penetrino nel sottovolume ECMA, creato per evidenziare un margine all'interno della cellula in cui sono presenti podi invasivi. La vista del margine dorsale dimostra i podi invasivi inseriti nel gelatina sottostante.

La vista del margine ventrale mostra protrusioni nei podi di Veda e aree di degradazione della gelatina sotto il vetrino coprioggetto come regioni rosse presenti nella matrice verde. Queste immagini mostrano alcuni dei passaggi importanti per la quantificazione della degradazione normalizzata della matrice di gelatina da parte delle cellule all'interno di un'intera immagine microscopica. Tutte le immagini fluorescenti sono state convertite in scala di grigi per visualizzare meglio la soglia rossa e le delimitazioni delle regioni di interesse.

Questa immagine di gelatina coniugata con Oregon Green 488 mostra le aree scure in cui è avvenuta la degradazione. Mediante sogliatura, l'immagine della gelatina evidenzia le aree di degradazione, all'interno delle quali vengono selezionate regioni di interesse per misurarne l'estensione superficiale. Questa immagine mostra la rumina, il foid e la colorazione dell'actina F come previsto.

La soglia nell'immagine dell'actina evidenzia l'area totale della cellula da cui vengono selezionate le aree cellulari da misurare. Analogamente, la tecnica può essere applicata per analizzare immagini di nuclei cellulari colorati con DAPI. Questo pannello illustra alcuni passaggi selezionati coinvolti nella quantificazione della degradazione fluorescente della gelatina da parte di singole cellule all'interno di una popolazione cellulare mista.

Questa semplice quantificazione riguarda una singola cellula OSC 19 transfettata che sovraesprime cortactina ricombinante fusa al marcatore epitopico flag. Si noti come il degrado della matrice operato dalle cellule transfettate possa essere analizzato anche all'interno di una popolazione mista di cellule transfettate e non transfettate. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante tenere a mente diverse considerazioni.

Prima di tutto, assicurarsi che i marcatori fluorescenti delle cellule non si sovrappongano al colore della gelatina fluorescente. Quando si acquisiscono le immagini, è importante scegliere i campi in base alla presenza delle cellule. Non cercare in modo preferenziale aree di degradazione, poiché ciò potrebbe introdurre un bias nei dati a causa della variabilità tra le linee cellulari e delle risposte a diversi agenti terapeutici.

Fattori come il tempo di degradazione del numero di sedi e la selezione delle proteine per l'etichettatura immunofluorescente devono essere ottimizzati per il tuo esperimento specifico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare coprioggetti uniformemente rivestiti con gelatina fluorescente per saggi di degradazione mediata da beta podia, nonché dei metodi per la quantificazione della degradazione della matrice.