Studiare proteolisi della ciclina B a livello di singola cellula in popolazioni di cellule intere

Lo scopo di questa procedura è monitorare come la proteolisi della ciclina B regoli l'inizio dell'anafase e l'uscita dalla mitosi. Questo viene ottenuto innanzitutto seminando cellule reporter rapide della ciclina B su vetrini per microscopia. Il secondo passaggio consiste nell'etichettare la molecola reporter chimera della ciclina B con il substrato fluorescente TMR star.

Successivamente, le serie di immagini vengono acquisite presso una stazione microscopica. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare le cellule e nel calcolare l'intensità della fluorescenza di TMR star nel tempo, che riflette la proteolisi della ciclina B. In definitiva, la microscopia a immunofluorescenza di cellule vive reporter rivela la cinetica della proteolisi della ciclina B che avviene durante la mitosi.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il monitoraggio della BGFP ciclone, è che ciclone B SNAP permette il monitoraggio del degrado di ciclone B anziché dell'espressione dell'intera proteina. Per questo esperimento, le cellule reporter snap vengono inizialmente fatte crescere in modo asincrono in fase logaritmica per almeno 48 ore. Per iniziare, la procedura di semina della tripsina prevede l'uso di cellule reporter snap subconfluenti, da seminare sulle camere microscopiche a otto pozzetti con una distribuzione costante su tutta la superficie della centrifuga della camera.

10.000 cellule e Resus vengono sospesi in 350 microlitri di un mezzo di crescita normale privo di rosso fenolo. Trasferire la sospensione cellulare nella camera del microscopio per la semina delle cellule in camere microscopiche a otto pozzetti, con densità cellulare massima al centro della camera. Inizialmente, caricare la camera con 300 microlitri di mezzo di crescita normale privo di rosso fenolo.

Successivamente, aggiungere con attenzione 5.000 cellule al centro della camera del microscopio per la semina delle cellule su piastre da 96 pozzetti con ottiche speciali, garantendo una distribuzione costante su tutta la superficie del pozzetto. Centrifugare a 5.000 cellule e risospendere in 300 microlitri di mezzo di crescita normale senza rosso fenolo, in base al numero totale di pozzetti contenenti cellule richiesti. Regolare il numero di cellule e il volume totale del mezzo di sospensione.

Quindi trasferire la sospensione cellulare in una piastra a 96 pozzetti per la semina delle cellule su piastre ottiche speciali a 96 pozzetti con densità cellulare massima al centro del pozzetto. Aggiungere con attenzione 1.500 cellule in 15 microlitri di mezzo di crescita normale privo di rosso fenolo sotto forma di una piccola goccia al centro di ogni pozzetto.

Questo limiterà la crescita cellulare al centro del pozzetto. Lasciare crescere tutte le cellule seminate per almeno 18 ore in condizioni standard di coltura cellulare, 30 minuti prima dell'inizio della procedura di colorazione. Riscaldare le quantità di mezzo di crescita normale senza rosso fenolo a 37 gradi Celsius.

Il substrato di fissaggio rapido in questa dimostrazione è TMR star per una facile manipolazione; sciogliere TMR star in DMSO per ottenere una soluzione madre con una concentrazione di 400 micromolare; diluire 0,5 microlitri della soluzione madre di TMR star in 200 microlitri di mezzo di crescita normale senza fenolo rosso e riscaldato per ottenere una concentrazione finale di marcatura di un micromolare. Successivamente, rimuovere il mezzo di crescita normale dalle cellule in crescita asincrona e sostituirlo con il mezzo di marcatura; incubare le cellule nel mezzo di marcatura per 25 minuti in condizioni di coltura standard.

Dopo 25 minuti, rimuovere il mezzo di marcatura e lavare le cellule quattro volte con mezzo di crescita normale privo di fenolo rosso e tiepido. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare le cellule in 300 microlitri di mezzo di crescita normale privo di fenolo rosso e tiepido per 30 minuti prima di trasportarle al microscopio. Sostituire il mezzo con mezzo di crescita normale fresco, privo di fenolo rosso e tiepido, per rimuovere il substrato snaps non legato; trasportare le cellule al microscopio in una scatola di polistirolo su un blocco riscaldante preriscaldato a 37 gradi Celsius.

Per ridurre al minimo le variazioni di temperatura, due ore prima della misurazione dell'intensità di fluorescenza regolare la temperatura dell'aria nella camera climatica a 37 gradi Celsius in modalità asciutta, in modo da portare il microscopio e tutti i suoi componenti alla temperatura desiderata. Per evitare la condensa e i conseguenti danni al microscopio, è importante preriscaldare il sistema prima di impostare l'umidità.

Quando l'intero sistema del microscopio ha raggiunto i 37 gradi Celsius, regolare l'umidità dell'aria al 60% e l'anidride carbonica al 5%. Avviare il software di scansione o acquisizione e definire le impostazioni standard. Definire le posizioni delle pozzette da analizzare. Impostare il delta T o il tempo del ciclo di acquisizione e il numero assoluto di cicli di acquisizione.

In questa dimostrazione, l'autofocus hardware è preselezionato per l'analisi di un numero maggiore di pozzetti. Avviare l'acquisizione e supervisionare i primi due cicli di acquisizione.

Il microscopio si focalizzerà sul segnale dell'istone H two GFP, acquisendo successivamente un'immagine iniziale in quel canale, prima che il filtro venga cambiato e venga acquisita l'immagine corrispondente con TMR star. Questa procedura viene ripetuta per tutte le posizioni all'interno di una pozzetta e per ciascuna delle pozzette da esaminare, prima di ripetere il ciclo successivo. Per analizzare i profili proteolitici, avviare il software di analisi scan R.

Analizzare le immagini con i nuclei cellulari visualizzati mediante istone H due GFP, definiti come oggetto principale utilizzando una soglia basata sull'intensità del segnale e un algoritmo watershed per facilitare la separazione delle cellule adiacenti. Deve essere creato un sottoggetto costituito dal nucleo con citoplasma per l'analisi di TMR star. Le proprietà importanti dell'oggetto principale sono le posizioni X e Y, il tempo e le intensità massime e medie di GFP per l'oggetto principale e l'intensità totale divisa per l'area.

Per il sottoggetto stella TMR, passare alla modalità traccia per visualizzare l'intensità media della fluorescenza della stella TMR nel tempo o le tracce cellulari assegnate ai principali oggetti analizzati. L'analisi di un numero elevato di cellule consente una prima visione rappresentativa e oggettiva, ma il numero di cellule da esaminare può essere ridotto selezionando solo quelle misurazioni che durano almeno 140 cicli e presentano un'intensità massima elevata della GFP dell'istone H due. Selezionare una traccia cellulare di interesse per visualizzare simultaneamente, a livello singola cellula, la GFP dell'istone H due e la fluorescenza della stella TMR.

Fare clic con il tasto destro del mouse su una cellula di interesse e generare un'immagine esportabile. Galleria per illustrare l'istone H two GFP e il cycling B snap TMR star per ogni singolo intervallo temporale. Passare alla modalità popolazione del software di analisi dello scanner e delimitare la regione in cui la cellula di interesse è rappresentata sul dot blot.

Applicare una nuova finestra di grafico a dispersione alla regione selezionata e visualizzare l'intensità media della fluorescenza di TMR star nel tempo. Esportare i dati in Microsoft Excel per ulteriori calcoli. Le figure qui mostrano la cinetica della Ciclina B rappresentata da una curva di intensità della fluorescenza di TMR star di una cellula che procede attraverso una mitosi regolare, senza segni di allineamento cromosomico alterato in seguito alla compattazione del citoplasma dopo la rottura dell'involucro nucleare o NEBD, come indicato dal triangolo rosso. L'intensità della fluorescenza di TMR staph mostra un brusco aumento fino al raggiungimento della finestra isomorfica.

Quando la cellula entra in prometafase, l'intensità di fluorescenza rimane a un livello stabile finché la cellula procede attraverso profase e metafase, per poi iniziare a diminuire rapidamente. Una volta che tutti i cromosomi hanno formato una piastra di metafase stabile, tale diminuzione precede la separazione dei cromosomi. Durante l'anafase, indicata dal punto blu sulla curva in fase tardiva della mitosi, la cromatina inizia a despiralizzarsi e la cellula assume una morfologia tipica della fase finale.

Quando la curva dell'intensità della fluorescenza si avvicina alla fase di plateau, che è inferiore al plateau precedente la mitosi dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della mitosi per esplorare l'equilibrio preciso tra il ciclo cellulare, la degradazione e la sintesi che regolano il progresso mitotico.