Multi-parametro di misura della apertura dei pori di transizione di permeabilità nel Cuore mouse mitocondri isolati

Lo scopo di questo video è descrivere un procedimento per caratterizzare la transizione della permeabilità mitocondriale. Apertura scarsa nei mitocondri, isolati dal cuore di topo. In primo luogo, i mitocondri vengono isolati dai cuori di topo.

Utilizzando il metodo di centrifugazione differenziale, la qualità delle mitocondri isolati viene quindi valutata mediante un elettrodo termico di ossigeno collegato a un computer per misurare il rapporto di controllo respiratorio e per valutare l'integrità della membrana mitocondriale. Successivamente, mediante strumentazione spettrofluorimetrica, la misurazione simultanea del controllo del calcio, del potenziale della membrana mitocondriale e del volume mitocondriale viene utilizzata per determinare la transizione di permeabilità. Apertura scadente.

I dati ottenuti hanno mostrato differenze nella capacità di ritenzione del calcio e nella transizione della permeabilità mitocondriale. Scarsa sensibilità dei mitocondri isolati, apertura della transizione della permeabilità mitocondriale. L'apertura del poro è un fenomeno complesso che coinvolge cambiamenti a diversi livelli della fisiologia e dell'anatomia mitocondriale.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti consiste nel fatto che la misurazione simultanea di più parametri offre una visione più completa del fenomeno rispetto alla misurazione di singoli parametri isolati, come il calcio, la mobilizzazione o il gonfiamento. Prima di iniziare la procedura, scongelare il buffer per l'isolamento dei mitocondri e verificare il pH, che deve essere pari a 7,4. Successivamente, porre tutti i buffer, le piastre e le provette che verranno utilizzati sul ghiaccio. Si noti che tutti i passaggi del protocollo di isolamento dei mitocondri devono essere eseguiti sul ghiaccio.

Posizionare i cuori di topi sacrificati su una piastra di Petri e rimuovere il sangue con tampone freddo per l'isolamento delle mitocondri. Successivamente, trasferire i cuori su una nuova piastra di Petri utilizzando una lametta, rimuovere il tessuto adiposo e le atria, quindi tritare i cuori fino a ottenere un prodotto omogeneo.

Trasferire i cuori tritati in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere 10 millilitri di buffer per l'isolamento dei mitocondri contenente tripsina 0,1 milligrammo per millilitro e lasciare digerire il campione sul ghiaccio per 10 minuti. Si noti che l'uso della tripsina aumenta il rendimento dei mitocondri isolati e deve essere mantenuto costante tra diverse preparazioni mitocondriali.

Tuttavia, si raccomanda di verificare la funzionalità dei mitocondri isolati su preparazioni ottenute in assenza di tripsina per assicurarsi che l'enzima non interferisca con i loro ioni. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 millilitri di buffer per l'isolamento dei mitocondri contenente 0,1% di BSA priva di acidi grassi e 5 milligrammi di inibitore della tripsina e mescolare capovolgendo il tubo diverse volte per neutralizzare la tripsina. Recuperare il tessuto digerito mediante centrifugazione a bassa o media velocità per un minuto a 4 gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, sospendere il tessuto in otto millilitri di tampone di isolamento delle mitocondri con BSA priva di acidi grassi allo 0,1%, mantenendo il campione sul ghiaccio. Utilizzare un omogeneizzatore motorizzato con pestello in teflon per omogeneizzare il campione con quattro a sei passaggi a 1.200-1.400 giri al minuto. Trasferire l'omogenato in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare a 800 × g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Per formare il pellet dei nuclei e dei detriti cellulari. Dopo la centrifugazione, recuperare il soprannatante contenente i mitocondri in provette da microcentrifuga e centrifugare a 8.000 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, il pellet presenterà uno strato bianco sulla sua superficie.

Utilizzare un sistema a vuoto per aspirare e rimuovere con attenzione lo strato bianco situato sulla parte superiore del pellet mitocondriale. Quindi risospendere nuovamente il pellet più scuro rimanente, che contiene i mitocondri, in un millilitro di buffer per l'isolamento dei mitocondri.

Successivamente, centrifugare i mitocondri a 8.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Eliminare il sopranatante e risospendere il pellet mitocondriale in 150 microlitri di buffer di isolamento dei mitocondri, mantenendo i mitocondri sul ghiaccio.

La respirazione di mitocondri isolati viene misurata con un elettrodo termico all'ossigeno collegato a un computer e controllato da oxy. Il software Plus, l'elettrodo all'ossigeno deve essere tarato il giorno dell'esperimento. Aggiungere due millilitri di tampone per la respirazione mitocondriale contenente una concentrazione finale di un micromolare di rotenone nella camera dell'oxy, sigillare la camera e iniziare la registrazione del segnale di ossigeno.

Il segnale registrato dal sistema e visualizzato sullo schermo del computer è proporzionale alla concentrazione di ossigeno nella camera dell'ossitermo. Una volta che il segnale dell'ossigeno è stabile, aggiungere 250 microgrammi di mitocondri e registrare la respirazione basale per un minuto. A questo punto, la respirazione dovrebbe essere molto bassa poiché i mitocondri stanno utilizzando substrati endogeni.

Questa è la respirazione nello stato uno. Aggiungere succinato a una concentrazione finale di cinque millimolari per avviare la respirazione mitocondriale al complesso due e registrare il segnale per un minuto. Il consumo di ossigeno dovrebbe aumentare durante la respirazione nello stato due.

Per indurre la respirazione allo stato 3, aggiungere un DP a una concentrazione finale di 150 micromolare. A questo punto, il consumo di ossigeno dovrebbe aumentare a causa della sintesi di TP mediante fosforilazione ossidativa. Registrare il segnale fino a quando la respirazione rallenta, indicando il consumo di DP e la transizione alla registrazione della respirazione allo stato 4.

Stato quattro, respirazione per almeno un minuto. Aggiungere CCCP a una concentrazione finale di un micromolare e registrare il segnale per un minuto. A questo punto, la respirazione disaccoppiata dovrebbe essere massimale.

Calcolare il rapporto di controllo respiratorio dividendo la velocità di consumo di ossigeno durante la fase tre della respirazione per la velocità di consumo di ossigeno durante la fase quattro della respirazione; un valore di RCR target deve essere superiore a quattro. Successivamente, per valutare l'integrità della membrana mitocondriale, indurre la respirazione in fase tre in un nuovo campione di mitocondri aggiungendo ADP a una concentrazione finale di un millimolare.

Quindi registrare il consumo di ossigeno per un minuto, aggiungere citocromo C a 10 micromolare e registrare il consumo di ossigeno per due-tre minuti. Poiché il citocromo C è impermeabile alle membrane mitocondriali integre in una preparazione mitocondriale di buona qualità, non si avrà alcun aumento oppure un aumento molto lieve della respirazione. Un aumento della respirazione indica membrane mitocondriali rotte o danneggiate.

Lo strumento per la misurazione multiparametrica dell'apertura del poro di transizione della permeabilità mitocondriale è costituito da uno spettrofluorimetro dual emission Quantum Master controllato tramite il programma Felix GX. Utilizzando il programma Felix GX, creare un protocollo di acquisizione multidi e inserire i parametri per la misurazione del calcio, del potenziale di membrana mitocondriale e del gonfiamento per i coloranti ratiometrici, Forer e JC one, generando tracce derivate per il rapporto e il rapporto JC one in una cuvetta monouso quadrata in metacrilato. Preparare un millilitro di tampone per saggio mitocondriale con una concentrazione finale di un micromolare di rotenone, cinque millimolari di succinato e 800 nanomolari di For a FF, aggiungere 250 microgrammi di mitocondri e posizionare il campione nel compartimento del campione dello spettrofluorimetro.

Iniziare a registrare i segnali fluorescenti dopo un minuto, interrompere l'acquisizione, aggiungere 500 nanomolar di JC uno e quindi riprendere l'acquisizione. Il segnale del rapporto JC uno dovrebbe aumentare, indicando il uptake da parte dei mitocondri attivi. Continuare la registrazione finché il segnale di JC uno non ha raggiunto una fase di plateau.

Di solito entro cinque minuti, aggiungere cloruro di calcio fino a una concentrazione finale di 20 micromolare. Si dovrebbe osservare un aumento istantaneo del segnale del rapporto Fluor FF, che indica un incremento della presenza di calcio nel tampone del saggio, seguito da una diminuzione graduale dovuta all'assorbimento mitocondriale del calcio. Il segnale del rapporto JC uno dovrebbe mostrare una breve diminuzione transitoria, indicativa di una leggera depolarizzazione della membrana mitocondriale.

Quando il segnale del rapporto ER FF ritorna al livello basale, solitamente entro uno-due minuti con un ulteriore aggiunta di 20 micromoli di cloruro di calcio, continuare le stimolazioni a intervalli fissi finché i mitocondri non riescono più ad accumulare calcio e iniziano a rilasciarlo nel buffer di saggio. L'apertura del poro di transizione della permeabilità mitocondriale è visualizzata dall'aumento contemporaneo del segnale del rapporto URA FF dovuto al rilascio di calcio. Una diminuzione del rapporto del segnale JC-1, causata dal collasso del potenziale di membrana, e una riduzione della diffusione della luce dovuta al gonfiamento mitocondriale, mentre isolati da topi C57BL/6J.

Come mostrato in questo video, il consumo di ossigeno è stato quindi misurato durante la respirazione nello stato tre in presenza di succinato e ADP e durante la respirazione nello stato quattro dopo il consumo di ADP. Come mostrato qui, l'aggiunta di ADP aumenta il consumo di ossigeno a causa della fosforilazione ossidativa e il consumo di ossigeno rallenta. Una volta che tutto l'ADP è stato consumato, la risposta dei mitocondri isolati all'uncoupling viene misurata aggiungendo CCCP in presenza di CCCP. La velocità di consumo di ossigeno è più elevata rispetto a quella osservata durante la respirazione nello stato tre, al fine di valutare l'integrità della membrana dei mitocondri isolati.

Il consumo di ossigeno è stato misurato in presenza di succinato e un DP e dopo l'aggiunta di citocromo C. Come si può osservare, l'aggiunta di citocromo C non aumenta significativamente il consumo di ossigeno rispetto al DP e al succinato, indicando che le membrane mitocondriali integre non sono permeabili al citocromo C. Per valutare la transizione della permeabilità mitocondriale, l'apertura del poro mitocondriale indotta da calcio è stata utilizzata come indicatore della capacità di ritenzione del calcio nei mitocondri isolati dal cuore. La transizione della permeabilità mitocondriale. L'apertura del poro è stata innescata da aggiunte sequenziali di 20 micromolar.

Il cloruro di calcio, il calcio extramitocondriale e il potenziale di membrana sono stati misurati mediante indicatori raziometrici. URA FF mostrato come traccia verde e JC uno mostrato come traccia rossa; il rigonfiamento delle mitocondrie è stato misurato registrando la dispersione della luce a 525 nanometri, indicata dalla traccia nera. La specificità dei segnali di JC uno e del rigonfiamento è stata verificata con un micromolare di CCCP e cinque microgrammi per millilitro della tossina microbica etina; come si può osservare qui, l'assorbimento del calcio da parte delle mitocondrie è accompagnato da un lieve depolarizzazione della membrana mitocondriale.

Dopo quattro impulsi di calcio, l'apertura della pora di transizione della permeabilità mitocondriale è osservata come un aumento del FF di URA, indicativo del rilascio di calcio. Una diminuzione del JC-1 indica il collasso del potenziale di membrana e un aumento del volume della matrice mitocondriale, che si manifesta come una riduzione della diffusione della luce, utilizzata come marcatore del gonfiamento per verificare la specificità dell'apertura della pora di transizione della permeabilità mitocondriale. Le stesse misurazioni sono state effettuate in presenza di ciclosporina A, che si lega al componente ciclofillina D della pora di transizione della permeabilità mitocondriale. Come mostrato in questa figura, la presenza di un micromolare di ciclosporina A aumenta il numero di impulsi di cloruro di calcio necessari per aprire la pora di transizione della permeabilità mitocondriale rispetto al campione di controllo.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare l'apertura del poro di transizione della permeabilità mitocondriale in mitocondri cardiaci isolati. L'aspetto più complesso di questa procedura consiste nell'ottenere mitocondri isolati di buona qualità. È quindi fondamentale eseguire misurazioni di controllo della qualità prima di utilizzare i mitocondri in ulteriori esperimenti.