Microdialisi di etanolo durante la determinazione operante auto-amministrazione ed etanolo etanolo mediante gascromatografia

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare i livelli di etanolo nel dializzato cerebrale durante una sessione di autoiniezione di etanolo. Per confrontare questa misura con i comportamenti sincroni di autoiniezione, si procede innanzitutto con l'implantazione chirurgica di una guida per microdialisi, una cannula e un bullone di fissaggio, seguita dall'addestramento dei ratti ad autoiniettarsi etanolo in modo operante. Il secondo passaggio consiste nell'abituare i ratti al collegamento del cavo cranico, in modo che non ostacoli l'autoiniezione di etanolo durante la microdialisi.

Successivamente, viene eseguita la microdialisi durante una sessione di auto-amministrazione di etanolo, durante la quale una porzione del dializzato viene preparata per l'analisi dell'etanolo. In seguito, i campioni di dializzato vengono analizzati per determinare la concentrazione di etanolo mediante gascromatografia con rivelazione a ionizzazione di fiamma. Infine, i risultati ottenuti mostrano l'andamento temporale del raggiungimento della regione cerebrale d'interesse da parte dell'etanolo durante una sessione di auto-amministrazione.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la puntura della coda o della vena safena, è che questa procedura è minimamente invasiva al momento del prelievo del campione e consente la misurazione del farmaco nel tempo nella regione cerebrale di interesse mentre l'animale esegue un compito comportamentale. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché richiede numerose competenze specialistiche, molte delle quali possono essere acquisite solo attraverso una pratica ripetuta o l'esperienza. La procedura sarà inoltre dimostrata da Jeffrey Dilley, un assistente di ricerca undergraduate del nostro laboratorio.

Tutte le procedure sugli animali mostrate sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università del Texas e seguono tutte le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Per questi esperimenti di microdialisi comportamentale si utilizzano ratti Long Evans ben addestrati, ospitati presso un impianto accreditato ALAC dell'Università del Texas ad Austin, ai quali è stata chirurgicamente impiantata una cannula da 21 gauge sopra la regione cerebrale di interesse. Tutti gli animali devono ricevere almeno una settimana di cure post-operatorie e di recupero e devono essere in buona salute prima di iniziare le seguenti procedure.

Posizionare il ratto in una camera operante Med Associates, dotata di una leva retrattile Lichter e di un tubo erogatore, e addestrarlo a premere la leva per accedere a una soluzione di saccarosio al 10%. Una volta che il ratto è stato addestrato a rispondere per la soluzione di saccarosio, iniziarlo con un programma di addestramento appropriato durante il quale l'etanolo viene aggiunto gradualmente alla soluzione in più sessioni di assunzione la notte precedente la penultima sessione operante. Dopo aver anestetizzato l'animale e verificato il livello di sedazione, collegare la molla del tethere al bullone del tethere sulla base cranica del ratto per abituarlo all'apparato, costituito da una leva bilanciata, un braccio, un tethere girevole, una molla e un supporto ad anelli.

Lasciare che il ratto trascorra la notte nella stanza operante nella sua gabbia con accesso libero a cibo e acqua, quindi completare la sessione di addestramento del giorno successivo con il tether e l'apparecchiatura associata posizionati il giorno precedente all'esperimento di microdialisi. Dopo aver anestetizzato il ratto con isoflurano, verificare lo stato di sedazione eseguendo una compressione del dito del piede ed inserire una sonda per microdialisi perfusa con liquido cerebrospinale artificiale. Fissare correttamente la sonda, quindi regolare la portata della sonda a 0,2 microlitri al minuto.

Posizionare il ratto nella sua gabbia abituale nella stanza operante per trascorrere la notte con tutta l'apparecchiatura per dialisi in posizione, fornendo cibo e acqua ad libitum. Il giorno successivo all'inserimento della sonda, almeno due ore prima dell'inizio dell'esperimento, aumentare la sonda fino alla sua portata operativa. Utilizzando una siringa Hamilton, verificare che la portata della sonda sia costante e pari almeno al 90% della portata impostata.

Se si valutano i neurotrasmettitori nei campioni di dialisi, prelevare campioni durante tutte le fasi dell'esperimento. Iniziare raccogliendo campioni di dialisi mentre l'animale si trova nella sua gabbia di mantenimento. Conservare i campioni in modo appropriato per analisi successive.

Trasferire con attenzione il ratto nella camera operante e avviare il programma operante che controlla la camera. Continuare a prelevare campioni mentre il ratto attende che la leva si estenda nella camera, prelevando due campioni prima che la leva si estenda. Iniziare a raccogliere una porzione di ciascun campione di dializzato per l'analisi dell'etanolo prelevando con pipetta un'opportuna aliquota di dializzato in un vial di vetro da due millilitri e sigillare il vial con un settore ermetico; pipettare e sigillare rapidamente i campioni di etanolo.

Poiché l'etanolo è volatile e il volume del campione è ridotto, una preparazione del campione incoerente o lenta porterà a risultati inaccurati. Conservare il residuo per l'analisi dei neurotrasmettitori. Il periodo di consumo di 20 minuti inizia dopo che il programma del computer Med Associates estende la leva nella camera e il ratto la preme per accedere a una bottiglia di soluzione da bere.

Continuare a prelevare campioni per tutto il periodo di assunzione della bevanda; al termine di questo periodo, il programma informatico ritrae la bottiglia dalla camera. Mantenere l'animale nella camera per un ulteriore periodo post-bevanda di 20 minuti alla fine dell'esperimento di microdialisi. Dopo aver anestetizzato il ratto, rimuovere la sonda.

Se l'animale non viene immediatamente soppresso in modo umano, sostituire l'obturatore per garantire la visualizzazione del percorso della sonda. Raccogliere il cervello entro tre giorni dall'esperimento. Analizzare i campioni insieme a standard esterni di etanolo mediante gascromatografo dotato di rivelatore a ionizzazione di fiamma, un autosampler in fase di testa riscaldato a 50 gradi Celsius e una colonna capillare con elio come fase mobile.

Per registrare e analizzare i cromatogrammi, utilizzare un software per stazione di lavoro cromatografica per preparare il sistema all'analisi dell'etanolo. Utilizzare un bagno d'acqua a ricircolo per riscaldare la piastra del campionatore automatico e aprire le bombole di aria e idrogeno. Successivamente, avviare il programma di accensione.

Quando è pronto, avviare una combustione della durata di 20 minuti, che decontamina la fibra. Preparare gli standard utilizzando un matraccio tarato da 100 millilitri per diluire 238 microlitri di etanolo al 95% con acqua fino a un volume finale di 100 millilitri. Utilizzare una diluizione seriale uno a uno per creare gli standard.

Trasferire con pipetta gli standard in vial di vetro e sigillarli esattamente come i campioni sono stati preparati. Assicurarsi di eseguire anche un bianco di acqua insieme agli standard. Posizionare gli standard e i campioni nel vassoio del campionatore automatico e riscaldarli fino a quando l'intera aliquota liquida è stata vaporizzata.

Per eseguire standard e campioni, creare un elenco dei campioni indicando quale campione si trova in ciascun alloggiamento del campionatore automatico, specificando che ogni campione deve essere perforato. Una volta instradati i file dati in una cartella selezionata, scegliere un metodo appropriato per i campioni e avviare l'analisi. Dopo che il sistema ha elaborato tutti i campioni, verificare che il programma abbia integrato correttamente ciascun picco.

Tracciare l’altezza del picco in funzione di ciascuno standard esterno noto. Concentrazione di etanolo. Utilizzare la funzione lineare ottenuta dai punti per interpolare la concentrazione di etanolo di ciascun campione di dializzato.

Questa figura mostra esempi di cromatogrammi per tre concentrazioni di standard di etanolo e uno per un campione di dializzato di ratto raccolto al termine della sessione di auto-somministrazione di etanolo. I picchi di etanolo dovrebbero essere relativamente simmetrici, avere tempi di ritenzione costanti e un rapporto segnale-rumore superiore a 10. Il mancato rispetto di questi criteri indica che il sistema necessita di manutenzione, una cromatografia di qualità e standard corretti producono una curva standard lineare che viene utilizzata per calcolare la concentrazione di etanolo nei campioni di dializzato raccolti da animali che auto-somministrano etanolo nel corso della loro auto-somministrazione.

Le concentrazioni di etanolo nel dializzato derivato non sono corrette per il recupero del microdosatore in vivo e rappresentano solo una frazione della concentrazione tissutale cerebrale di etanolo. Se è richiesta una microdialisi quantitativa dell'etanolo, la frazione di estrazione dell'etanolo che diffonde dallo spazio extracellulare all'interno del microdosatore viene determinata sperimentalmente. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita correttamente in circa quattro o cinque ore.

Questo varierà in base alla durata della sessione comportamentale. Il completamento con successo della fase di microdialisi dell'esperimento dipende in larga misura dalla qualità delle fasi preparatorie. Quando si tenta questa procedura, è importante assicurarsi che i ratti siano stati ben manipolati e che siano stati abituati a eventuali stimoli potenzialmente disturbanti che potrebbero verificarsi durante l'esperimento di dialisi, in modo che il comportamento di auto-somministrazione dell'animale non venga influenzato.