Identificazione dei volatili olfattive utilizzando la gas cromatografia-Multi-unit Recordings (GCMR) nel lobo antennale Insetto

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare gli odoranti biologicamente attivi in una miscela complessa analizzando le registrazioni effettuate nel cervello del bombice. Questo risultato si ottiene innanzitutto raccogliendo le sostanze odorose che producono effetti comportamentali, e in secondo luogo preparando il gascromatografo e i sistemi di registrazione multicanale per l'esperimento. Il terzo passaggio consiste nel preparare e dissezionare il cervello del bombice per effettuare le registrazioni neurali nel lobo antennale.

L'esperimento viene quindi condotto inserendo gli elettrodi in un lobo antennale e misurando le risposte ai composti volatili erogati, analizzando l'attività neuronale in risposta a odori complessi e ai loro singoli costituenti. È possibile identificare gli odoranti biologicamente attivi ottenuti mediante cromatografia gassosa. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altre, come la G-C-E-A-G, consiste quindi nella sensibilità dei neuroni del lobo antennale e nella capacità di caratterizzare come i neuroni cerebrali rispondono a specifici composti volatili floreali.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché le fasi combinate di analisi elettrofisiologica e chimica analitica sono difficili da apprendere a causa della tecnica di registrazione della preparazione elettrofisiologica e dei passaggi necessari per raccogliere le sostanze volatili presenti nel sopraliquido. Sebbene questa tecnica possa fornire informazioni sul trattamento olfattivo dei bombi, può essere applicata anche ad altri sistemi, come fattori legati a malattie trasmessi da zanzare o triatomini, oppure a parassiti agricoli come afidi o farfalle. Per questa procedura, si prepari un elettrodo di riferimento realizzato con un filo di tungsteno montato su un micromanipolatore in un secondo momento.

Il micromanipolatore è dotato di un elettrodo multicanale, come un filo avvolto, un elettrodo tede o un elettrodo multicanale in silicio, collegato a un preamplificatore che dispone di un gascromatografo con uscita su un tavolo schermato BNC. L'uscita del rilevatore del gascromatografo è interfacciata con l'amplificatore e il sistema di acquisizione dati in modo che i segnali neurali e quelli del gascromatografo siano sincronizzati. In questo esempio, il gas trasportatore del gascromatografo è elio ed è presente in una colonna gascromatografica DB5.

Il GC utilizza un'iniettore a divisione del flusso con la temperatura impostata a 200 gradi Celsius e il rilevatore a ionizzazione di fiamma con la temperatura impostata a 230 gradi Celsius. Dopo che i campioni sono stati riscaldati nel gc, l'effluente dalla colonna viene suddiviso in parti uguali tra il rilevatore a ionizzazione di fiamma e l'antenna B mediante un connettore a Y in vetro. In questo esempio, il GC viene utilizzato per inviare i composti volatili raccolti mediante assorbimento dinamico dai fiori di Mimus Lewis eye, una pianta selvatica alpina originaria della California.

In alternativa, invece di utilizzare il gc, singoli composti volatili o miscele di composti possono essere somministrati mediante impulsi d'aria. Inviati attraverso una siringa di vetro separata contenente un pezzo di carta da filtro su cui sono stati depositati i composti. Gli impulsi d'aria vengono deviati da un flusso d'aria costante mediante una valvola attivata da un solenoide controllata da un computer.

Iniziare le preparazioni tagliando circa un centimetro dall'estremità di una punta per pipetta da un millilitro. Inserire un bombice nella base della punta per pipetta e spingerlo delicatamente verso l'estremità opposta finché non sia visibile solo la testa. Utilizzando cera da dentista fusa, creare uno stampo intorno alla testa esposta.

La cera deve aderire agli occhi composti per immobilizzare completamente la testa, ma non deve entrare in contatto con le antenne, se necessario. Utilizzare piccoli perni per immobilizzare le antenne. Successivamente, praticare un'incisione a forma di finestra quadrata nel capo utilizzando una lama affilata, come un microbisturi.

Iniziare a tagliare direttamente dietro l'antenna e adiacente a uno degli occhi composti. Tagliare una linea retta tra gli occhi. Successivamente, tagliare in senso dorsale fino a quando la capsula cranica si incurva verso il torace.

Continuare il taglio fino all'estremità opposta della capsula cefalica. Infine, tagliare nuovamente verso l'inizio per completare il quadrato. Utilizzare una pinza per rimuovere la cuticola.

È necessario rimuovere la cuticola adiacente all'antenna, altrimenti ostacolerà l'elettrodo non appena il cervello sarà esposto. Subito dopo, irrorare abbondantemente il tessuto con soluzione salina per insetti. Assicurarsi che i lobi antennali siano ben esposti.

Quindi, utilizzare con attenzione una pinzetta molto fine per rimuovere la guaina perineurale immediatamente al di sopra dei lobi antennari. Fare molta attenzione a non perforare il cervello dell'ape con la pinzetta. Il preparato dell'ape è ora pronto per la registrazione elettrofisiologica.

Cominciare fissando l'ape preparata a una pinza collegata a una base magnetica. Mantenerla continuamente perfusa con soluzione salina per insetti erogata da un serbatoio dotato di un regolatore di flusso. Inserire quindi l'elettrodo di riferimento nel tessuto cerebrale controlaterale.

Successivamente, inserire l'elettrodo multicanale nell'uno dei lobi antennali dell'ape. Quando gli elettrodi sono in posizione, attendere da 30 a 60 minuti affinché le registrazioni si stabilizzino.

In questo periodo, prepararsi a rilevare i picchi extracellulari dai neuroni applicando anche un confronto con una soglia. Potrebbe essere necessario un'impostazione manuale della soglia per alcuni canali a causa del rumore presente nei canali di registrazione. Successivamente, verificare che la rampa di temperatura della corsa in gascromatografia sia corretta.

In questo esempio, la temperatura parte da 50 gradi Celsius per quattro minuti e poi aumenta di 10 gradi al minuto fino a una temperatura finale di 220 gradi Celsius, oppure viene mantenuta per sei minuti. Quando le forme d'onda delle unità nei canali di registrazione diventano costanti, si ritiene che le registrazioni neurali siano stabili. Una volta stabilizzate, caricare la siringa con l'odore del capolino raccolto nello spazio di testa e iniettare l'odore nel portello di iniezione in testa del gc.

Quindi iniziare immediatamente la registrazione dagli elettrodi non appena la corsa in gascromatografia è terminata. Lasciare riposare il preparato per cinque-quindici minuti. Successivamente, iniettare un altro campione nella gascromatografia oppure stimolare il preparato utilizzando singoli composti volatili o miscele di composti.

Se in qualsiasi momento l'attività spontanea dovesse improvvisamente interrompersi o cambiare, verificare la goccia di soluzione salina e lasciare riposare il preparato per 15 minuti. Se l'attività non dovesse tornare al livello precedente, scartare il preparato. Al termine dell'esperimento, fissare il cervello lasciando i microelettrodi ancora inseriti nel tessuto, quindi escindere il cervello, rimuovere il fissativo e disidratare il cervello.

Le posizioni dei canali di registrazione possono quindi essere identificate mediante microscopia confocale a partire dal profumo floreale di mimus Luci. Il numero totale di composti volatili viene recuperato attraverso. La CG comprende tipicamente tra 60 e 70 composti.

L'odore di Mimus Luci è composto principalmente da monoterpenoidi, tra cui beta myosin e alpha pinine. La parte restante dell'odore è costituita da composti volatili a sei atomi di carbonio. Diverse preparazioni sono state stimolate con tre microlitri di estratto oculare di Mimus Lewis.

Questa registrazione, proveniente da una delle otto unità neurali registrate tramite l'elettrodo multicanale, mostra quanto un neurone possa essere selettivo nei confronti di composti volatili specifici. In questo esempio, il composto presentato è il dine. Di seguito sono riportate le risposte delle otto unità neurali.

Circa metà dell'ensemble non ha risposto. Questo è sorprendente data la diversità di composti volatili menzionati nello spazio gassoso floreale, ma questo risultato è coerente tra diverse preparazioni ed è riportato anche da altri studi. Il tasso di attivazione normalizzato delle unità responsivi mostra una forte selettività verso un gruppo di odoranti.

Gli odoranti evidenziati dalle frecce hanno provocato le risposte più intense. Si tratta della demina e del trans beta osaine. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come preparare l'insetto per l'esperimento e quindi eseguire l'esperimento utilizzando la gascromatografia con registrazione multicanale.

L'obiettivo è quindi identificare odoranti putativamente efficaci dal punto di vista comportamentale all'interno di un bouquet complesso. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o tre ore se effettuata correttamente seguendo questa procedura. Altri metodi, come test comportamentali con gli odoranti identificati, possono essere eseguiti per determinare completamente l'efficacia dei composti volatili nel modulare la risposta comportamentale dell'insetto.