Un protocollo semplice per Estrazione emociti da bruchi selvaggi
15 novembre 2012
Emociti insetti svolgere molte funzioni importanti, sia immunitarie e non immunitarie, durante tutte le fasi di sviluppo degli insetti. La nostra attuale conoscenza dei tipi di hemocyte e la funzione viene da studi su insetti modelli genetici. Qui vi presentiamo un metodo per l'estrazione, la quantificazione e la visualizzazione di emociti da bruchi selvatici.
L'obiettivo generale di questa procedura è estrarre, visualizzare e contare gli emiociti da bruchi selvatici. Questo viene ottenuto anestetizzando prima il bruco ponendolo sul ghiaccio, iniettandolo con una soluzione tampone contenente un anticoagulante e riportando il bruco sul ghiaccio per permettere agli emiociti di rientrare in circolazione prima dell'estrazione. Il secondo passaggio consiste nel praticare un'incisione superficiale all'estremità posteriore del bruco utilizzando un bisturi pulito.
Successivamente, il bruco viene delicatamente compresso utilizzando pinzette morbide. Quindi, la miscela di linfa ematica e soluzione tampone viene aspirata mediante una micropipetta e raccolta in un tubo da microcentrifuga. L'ultimo passaggio consiste nel mescolare delicatamente la soluzione di linfa ematica con un volume uguale di soluzione tampone e trasferire 10 microlitri della soluzione su un emocitometro per visualizzare e contare il numero di ematociti.
In definitiva, questo metodo di estrazione degli emo citi può essere utilizzato come un approccio rapido ed efficace per contare gli emoci da diverse specie di bruchi e conservarli come strumento per esaminare gli aspetti fisiologici della risposta immunitaria cellulare degli insetti. Il principale vantaggio di questa tecnica è che può essere impiegato per estrarre emo citi da bruchi con una riduzione molto limitata della regione pro. Altri modelli di bruchi vengono sottoposti a emorragia recidendo uno dei segmenti pro, permettendo l'estrazione degli emoci dal liquido che fuoriesce.
Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata per estrarre emociti da altre specie di insetti. Questo metodo può essere impiegato per rispondere a domande fondamentali nel campo dell'eco-immunologia, ad esempio in che modo la risposta immunitaria cellulare degli insetti varia in base alla qualità della dieta, allo stadio di sviluppo o all'esposizione a diversi patogeni. Per iniziare questa procedura, anestetizzare i larve allo stadio penultimo raffreddandole sul ghiaccio per 20 minuti prima dell'estrazione degli emociti.
Successivamente, inserire l'estremità smussata di un ago capillare pulito da 16 gauge nel tubo collegato a una siringa di vetro da 20 millilitri. Lasciare aperto sul banco del laboratorio il tubo contenente la soluzione di raccolta. Riempire lentamente il capillare con circa 10-15 microlitri di tampone.
Quindi appoggiare l'ago su una pallina di argilla posizionata accanto al microscopio stereoscopico. Collocare il bruchi in una capsula di Petri. L'insetto deve essere posizionato sul fianco in modo che le strutture sferiche siano chiaramente visibili.
Esaminando al microscopio stereoscopico, tenere fermo il bruco con un paio di pinzette e posizionare l'ago vicino a una delle sfere, dove il tegumento dell'insetto è generalmente più morbido. Premere quindi delicatamente l'ago capillare contro il corpo dell'insetto. Una volta che l'ago ha perforato il tegumento, iniettare il volume totale della soluzione nel bruco.
Il corpo della farfalla avrà un rigonfiamento dopo l'iniezione, ma non dovrebbe scoppiare né fuoriuscire liquido. Riposizionare la farfalla nella piastra di Petri con ghiaccio. Posizionare l'insetto in posizione dorsale per evitare che il tampone fuoriesca dalla ferita.
Ripetere le iniezioni per ciascun bruco utilizzato per l'estrazione dell'emolinfa. Successivamente, lasciare tutti gli insetti raffreddare sul ghiaccio per 30 minuti. A questo punto, posizionare il bruco in una piastra di Petri sotto il microscopio stereoscopico.
Effettuare con attenzione un'incisione superficiale lunga circa due-tre millimetri nella regione posteriore della larva, utilizzando un bisturi sterile senza danneggiare l'intestino o altri organi interni. Successivamente, comprimere delicatamente la larva usando un paio di pinzette di plastica flessibili, raccogliendo contemporaneamente circa 10-20 microlitri della miscela emolinfatica con una punta di pipetta da 10 microlitri. Ancora una volta, prestare attenzione a non lesinare i tessuti interni.
Successivamente, scartare i resti dei bruchi. Raccogliere l'emolinfa da ciascun bruco in provette microcentrifughe da 0,5 millilitri, silanizzate e opportunamente etichettate. Quindi aggiungere circa da 10 a 20 microlitri della soluzione di incubazione a ciascun campione di emolinfa raccolto da un singolo bruco.
Mantenere i campioni di emolinfa sempre sul ghiaccio in questo passaggio. Mescolare immediatamente il campione di emolinfa e la soluzione di incubazione prima del conteggio. He cytes.
Questo trattamento permette una corretta separazione degli emociti ed evita l'aggregazione. Utilizzare una punta di pipetta pulita per trasferire 10 microlitri di campione di emo linfa, mescolato con la soluzione di incubazione, su un emo citometro. Quindi, utilizzando un microscopio composto, contare e registrare il numero di emociti in almeno 15 dei quadrati grandi della griglia centrale dell'emo citometro.
Aggiungere questi valori per ottenere la somma totale del numero di emociti nelle 15 camere. Successivamente, risciacquare accuratamente l'emocitometro e il suo vetrino di copertura utilizzando un flacone con acqua distillata e deionizzata. Quindi asciugarlo con salviette Kim.
Ripetere le procedure per tutti gli altri campioni di emolinfa e calcolare il numero medio di ematociti per millilitro di volume di emolinfa per ciascun bruchiello. L'immagine al microscopio in campo chiaro mostra gli ematociti estratti da bruchi di nucle hin ai a un ingrandimento di 20 x. Dopo questa procedura, gli ematociti raccolti possono essere utilizzati per studiare la risposta immunitaria cellulare e impostare saggi come fagocitosi e cap, selezione dell'incapsulamento e attività della perossidasi.
Inoltre, R-N-A-D-N-A e proteine possono essere raccolte senza essere utilizzate per ulteriori saggi al fine di studiare queste risposte immunitarie cellulari negli insetti. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come iniettare bruchi per l'estrazione di emolinfa e di come raccogliere emolinfa contenente emociti vitali.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per estrarre, quantificare e visualizzare gli emociti da bruchi selvatici. Gli emociti svolgono ruoli fondamentali sia nelle funzioni immunitarie che in quelle non immunitarie durante lo sviluppo degli insetti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia degli insetti
- Funzione degli emociti
- Biologia dello sviluppo
Sfondo
- Gli emociti sono fondamentali per le risposte immunitarie negli insetti.
- Comprendere i tipi di emociti aiuta nello studio della biologia degli insetti.
- Le conoscenze attuali si basano principalmente su modelli genetici.
- Questo studio si concentra su bruchi selvatici per ampliare le conoscenze esistenti.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per l'estrazione degli emociti.
- Visualizzare gli emociti per comprendere meglio le loro funzioni.
- Quantificare gli emociti per valutarne il ruolo nella fisiologia degli insetti.
Metodi Utilizzati
- Anestetizzare i bruchi sul ghiaccio.
- Iniettare una soluzione tampone con anticoagulante.
- Eseguire un'incisione superficiale per facilitare l'estrazione degli emociti.
- Aspirare l'emolinfa e mescolarla con il tampone per l'analisi.
Risultati principali
- Estrazione e visualizzazione riuscita degli emociti.
- Quantificazione degli emociti mediante emocitometro.
- Dimostrata la fattibilità del metodo nei bruchi selvatici.
- Forniti approfondimenti sulla circolazione e la funzione degli emociti.
Conclusioni
- Il metodo consente uno studio efficace degli emociti nei bruchi selvatici.
- Migliora la comprensione delle risposte immunitarie negli insetti.
- Può essere applicato ad altre specie di insetti per studi comparativi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'estrazione e la quantificazione affidabili di emociti da bruchi selvatici permettono lo studio dei meccanismi immunitari innati in specie di insetti non modello, sostenendo la validazione precoce di bersagli nell'immunologia degli insetti. Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro standardizzato per l'isolamento delle cellule immunitarie, facilitando studi comparativi e saggi funzionali rilevanti per la ricerca traslazionale e l'eco-immunologia. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nella caratterizzazione della risposta immunitaria, informando decisioni basate sulla valutazione del rischio nei percorsi di scoperta che coinvolgono modelli di insetti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi della diversità e della funzione delle cellule immunitarie negli insetti di specie non modello.
- Supporta la riduzione dei rischi biologici fornendo accesso a cellule immunitarie primarie per studi meccanicistici.
- Facilita la validazione funzionale delle proteine bersaglio mediante saggi immunologici successivi.
- Migliora la fiducia predittiva delle ipotesi relative alle risposte immunitarie nella ricerca sugli insetti.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara campioni validati di emociti per saggi immunitari quantitativi e funzionali.
- Standardizza l'estrazione e il conteggio cellulare, favorendo la riproducibilità tra esperimenti.
- Consente la preparazione scalabile di emociti per lo screening degli effetti di patogeni o composti.
- Fornisce un numero affidabile di cellule per la normalizzazione dei saggi e l'analisi comparativa.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea agli studi di eco-immunologia consentendo il profilo immunitario in popolazioni selvatiche.
- Supporta la continuità dal campionamento sul campo a saggi funzionali basati su laboratorio.
- Facilita l'avanzamento di modelli di insetti adeguati al rischio per la ricerca traslazionale.
- Fornisce una riduzione del rischio di tipo meccanicistico per gli studi sulla modulazione immunitaria e sull'interazione con patogeni.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di estrazione degli emociti si colloca all'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e lo sviluppo di saggi, consentendo studi ipotesi-guidati sulle cellule immunitarie in modelli di insetti selvatici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla diversità e funzione delle cellule immunitarie in insetti non modello.
- Screening: Fornisce preparazioni standardizzate e quantitative di emociti per saggi immunitari successivi.
- Analisi: Fornisce conteggi cellulari e dati morfologici per confrontare le risposte immunitarie in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega il campionamento sul campo con il profilo immunitario in laboratorio per studi di eco-immunologia e studi comparativi.
- Riutilizzo aziendale: Offre un protocollo riutilizzabile adattabile a diverse specie di lepidotteri e insetti imparentati.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva negli studi sulle cellule immunitarie e riduce l'ambiguità meccanicistica nell'immunologia degli insetti.
- Valore operativo: Standardizza l'estrazione e il conteggio degli emociti per flussi di lavoro riproducibili e scalabili.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di tipo go/no-go nella ricerca immunologica basata sugli insetti e nei flussi di lavoro di eco-immunologia.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per il rischio dei modelli di insetti per studi funzionali e traslazionali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel manipolaggio degli insetti e nelle tecniche di microdissezione.
- Necessita dell'accesso a microscopi stereoscopici e ottici, emocitometri e strumenti sterili.
- Richiede una standardizzazione tra i gruppi di lavoro per le procedure di raccolta dei campioni e di conteggio cellulare.
- È adattabile a diverse specie di lepidotteri e insetti imparentati con modifiche minori.
- La resa del campione e la vitalità cellulare possono variare in base alla specie e allo stadio di sviluppo.
