A PCR-based metodo di genotipizzazione di distinguere tra le varietà selvatiche di tipo ornamentale e di Imperata cylindrica

L'obiettivo principale di questo procedimento è fornire un protocollo di genotipizzazione molecolare economico e rapido, in grado di discriminare tra varietà di Retta cylindrica, comunemente chiamata gon grass, che non possono essere distinte sulla base della sola morfologia. Questo risultato si ottiene innanzitutto identificando e isolando il tessuto da una varietà di gon grass di interesse. Il passaggio successivo consiste nell'estrazione del DNA nucleare e plastidiale dal tessuto raccolto.

Successivamente viene eseguita una reazione a catena della polimerasi sul DNA estratto utilizzando primer specifici per varietà che mirano alle differenze di sequenza nella regione LF del gene PLAs, insieme a controlli positivi e negativi appropriati. L'ultimo passaggio consiste nell'eseguire l'elettroforesi su gel per ciascuna delle quattro reazioni PCR al fine di visualizzare i prodotti amplificati. In definitiva, la varietà di erba gon raccolta viene determinata attraverso l'analisi delle bande dei prodotti PCR specifici per varietà ottenute sul gel. Le piante invasive costano agli Stati Uniti circa 3,4 miliardi di dollari all'anno, causando danni significativi sia alle risorse agricole che a quelle naturali.

Il tipo selvatico imparato Electrica, noto anche come erba Cogan, è una delle dieci erbacce invasive peggiori al mondo. L'erba Cogan forma popolazioni monospecifiche a diffusione rapida che spiazzano la vegetazione nativa e, di conseguenza, gli animali che dipendono da tale vegetazione. Attualmente, l'erba Cogan infesta 490 milioni di ettari in tutto il mondo e circa 500.000 ettari negli Stati Uniti. Una varietà ornamentale di ti di tus centrica è ampiamente commercializzata con i nomi di tus Centrica, Arbra, red Baren e Japanese blood crass, come la chiameremo JBG. Questa varietà è presumibilmente sterile e non invasiva, ed è considerata desiderabile per le sue foglie di colore rosso.

In determinate condizioni, l'erba giapponese del sangue può produrre semi vitali e tornare a una forma completamente verde che è indistinguibile dall'erba cogan di tipo selvatico. Come si può notare, entrambe presentano foglie verdi e sono più grandi della varietà ornamentale tradizionale, con foglie più grandi. Inoltre, le piante revertite e quelle di tipo selvatico possiedono rizomi più grandi rispetto alla varietà ornamentale, aumentando così il loro potenziale riproduttivo asessuale.

La reversione rende l'identificazione basata esclusivamente sulla morfologia un compito arduo. I metodi molecolari offrono un mezzo per distinguere con precisione piante infestanti e materiali vegetali che non possono essere identificati mediante osservazione visiva ordinaria.

I metodi molecolari sono fondamentali per prevenire la diffusione e l'introduzione di piante invasive. L'applicazione di questo protocollo molecolare consente di distinguere con precisione i reversioni dell'erba giapponese rossa dall'erba Kogan. Questo protocollo può contribuire a evitare la coesistenza con l'erba Kogan e la possibile formazione di ibridi vitali.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti, come l'analisi del polimorfismo della lunghezza dei frammenti amplificati, o A FLP, e ad altre metodiche come il sequenziamento del DNA, è che fornisce una tecnica di genotipizzazione molecolare molto economica e rapida, in grado di distinguere facilmente tra la kogan grass di tipo selvatico e le varietà di Japanese blood grass. La tecnica sarà dimostrata da Joseph Hery, uno studente universitario del nostro laboratorio. Per prima cosa, identificare un esemplare in un sito in cui la gon grass o la Japanese blood grass stanno crescendo e devono essere distinte l'una dall'altra.

Il graminaceo del sangue giapponese si distingue facilmente dal graminaceo selvatico di tipo comune per le sue foglie rosso brillante. Tuttavia, il rigetto del graminaceo del sangue giapponese è quasi indistinguibile dal graminaceo Kogan, poiché entrambi presentano foglie verdi più lunghe, una maggiore superficie fogliare e rizomi più grandi rispetto al graminaceo ornamentale giapponese. Questo metodo può essere utilizzato su tessuti fogliari freschi, congelati e recentemente essiccati.

Se si desidera conservare i tessuti per l'estrazione del DNA in una data successiva, il metodo migliore consiste nel congelare e conservare immediatamente il tessuto a meno 80 gradi Celsius. Se è necessaria la conservazione a secco, collocare il tessuto in una busta di carta e conservare la busta in gel di silice disidratato o in altri disidratanti attivi a temperatura ambiente. Se si utilizza tessuto fresco, assicurarsi che l'estrazione del DNA avvenga entro tre ore dal prelievo per prevenire il degrado.

Questa procedura utilizza il mini kit DNEZ per piante di Kyogen seguendo le istruzioni del produttore, con una piccola modifica. La procedura è stata adattata in modo da utilizzare più di 100 milligrammi di tessuto fresco o congelato oppure più di 20 milligrammi di tessuto essiccato. Per prima cosa, macinare più di 100 milligrammi di tessuto fogliare fresco o congelato, oppure più di 20 milligrammi di tessuto fogliare secco, fino a ottenere una polvere fine, utilizzando tre cicli di azoto liquido e macinando in un mortaio e pestello raffreddati.

Pesare la polvere congelata da tessuto fresco o congelato in aliquote da 100 milligrammi. Se si utilizza tessuto fogliare secco, pesare la polvere in aliquote da 20 milligrammi. Dopo questo passaggio, procedere con l'estrazione del DNA seguendo le istruzioni del produttore, utilizzando uno spettrofotometro come il test con spettrofotometro NanoDrop, DNA, qualità e quantità: rese di DNA adeguate dovrebbero essere comprese tra 50 e 150 nanogrammi per microlitro con rapporti 260/280 e 230/280 prossimi a 2,0 come mostrato qui.

Eseguire l'elettroforesi utilizzando un gel standard all'1% AROS. Verificare la presenza di bande relativamente grandi superiori a 10 KB senza o con minima striatura dovuta a contaminazione da RNA; se la concentrazione di DNA è elevata, diluire i campioni a 70 nanogrammi per microlitro per i passaggi successivi. I primer PCR utilizzati in questo protocollo, indicati dalle frecce rosse e verdi, si basano sulle differenze di sequenza tra la regione spaziatrice LF del genotipo di erba del Cogan e quello dell'erba giapponese del sangue.

Queste differenze si presentano sotto forma di polimorfismi a singolo nucleotide e inserzioni e delezioni indicate dalle frecce nere verticali, che permettono lo sviluppo di primer specifici per varietà. Posizionando i primer sui siti di sequenze uniche, le sequenze dei primer sono contenute nella parte scritta del protocollo; per ogni campione di DNA isolato, preparare due reazioni PCR da 50 microlitri in provette PCR da 0,2 millilitri a pareti sottili su ghiaccio utilizzando ciascun set di primer secondo il protocollo scritto. Se la concentrazione di DNA è bassa, si può aggiungere più DNA a ciascuna reazione, regolando la quantità di acqua distillata priva di nucleasi in modo che il volume totale della reazione rimanga di 50 microlitri.

Non utilizzare più di cinque microlitri di DNA o il 10% del volume totale per reazione, poiché le impurezze presenti nei campioni di DNA potrebbero inibire le reazioni di PCR. Per assicurarsi che tutti i reagenti per la PCR funzionino correttamente, preparare accuratamente il controllo positivo. Utilizzando i primer del controllo positivo, impostare anche il controllo negativo con lo stesso set di primer del controllo positivo, ma sostituendo il DNA estratto con acqua bidistillata. A questo punto, vi sono un totale di quattro reazioni di PCR per ciascun campione da analizzare. Successivamente, eseguire le amplificazioni PCR in un termociclatore dotato di coperchio riscaldato, utilizzando i parametri di ciclatura indicati nel protocollo scritto. Potrebbe essere necessaria un'ottimizzazione della temperatura di annealing, dei tempi di estensione e del numero di cicli, a seconda della qualità del DNA, dei primer, della polimerasi utilizzata o del tipo di termociclatore impiegato.

Una volta completate le reazioni di PCR, separare i prodotti di PCR su un gel all'1% utilizzando l'elettroforesi standard. Eseguire i campioni a circa 120 volt finché il fronte del colorante non raggiunge i tre quarti della lunghezza totale del gel. Visualizzare il gel sotto luce UV ed esaminare le bande risultanti per verificare se è stato amplificato un frammento di DNA appropriato.

Questo gel rappresentativo mostra i risultati dell'elettroforesi di prodotti di PCR derivati da campioni di DNA di erba Kogan, erba giapponese rossa e varietà revert dell'erba giapponese rossa, combinati con primer specifici per l'erba Kogan e per l'erba giapponese rossa, oltre al controllo positivo turn LF e a un controllo negativo senza stampo. Il set di primer del controllo positivo turn LF funziona in modo altrettanto efficace per l'erba Cogan, l'erba giapponese rossa, la varietà revert dell'erba giapponese rossa e altre graminacee, producendo una banda di 890 paia di basi. Se tutti i reagenti della PCR sono privi di contaminanti di DNA, la reazione del controllo negativo non produrrà alcun prodotto di PCR.

Se il campione di DNA proviene da erba kogan di tipo selvatico, una reazione PCR utilizzando il set di primer specifico per l'erba kogan produrrà una singola banda di circa 595 paia di basi, mentre i primer specifici per JBG non produrranno alcuna banda. Analogamente, se il campione di DNA proviene da JBG o da una reazione J-B-G-A-P-C-R revertita, l'uso del set di primer specifico per JBG produrrà una singola banda di circa 594 paia di basi, mentre i primer specifici per l'erba kogan non produrranno alcuna banda.

Poiché JBG e JBG revertito hanno la stessa sequenza di acidi nucleici, avranno di conseguenza lo stesso profilo di bande. Tuttavia, le differenze morfologiche tra JBG e i suoi revertiti sono abbastanza evidenti; quindi, anche se i risultati della PCR saranno identici, le varietà di JBG sono facilmente distinguibili a livello vegetale. Il sequenziamento del DNA dei prodotti della PCR può identificare eventuali variazioni nelle sequenze di DNA per diversi ecotipi di cogan grass.

Lo sviluppo di questa tecnica fornisce il primo metodo molecolare semplificato in grado di distinguere con precisione tra la forma selvatica di K e l'erba e la forma revertita della sua varietà ornamentale, l'erba giapponese rossa. Invitiamo gli utilizzatori di questo protocollo a contattarci per segnalare i risultati ottenuti mediante l'uso di questo protocollo. Tali informazioni condivise contribuiranno a fornire dati sulla distribuzione dell'erba giapponese rossa.

Questo aiuterà anche i regolatori del USDA a prendere decisioni informate riguardo ad azioni che potrebbero essere necessarie per evitare la diffusione e l'ibridazione potenziale delle varietà altamente invasive di erba Cogan.