Un test Galvanotaxis Analisi della Cinetica precursori neurali migrazione cellulare in un campo applicato esternamente diretto Corrente elettrica

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare la migrazione di cellule precursori neurali derivate da adulti in presenza di un campo elettrico in corrente continua. Questo risultato si ottiene isolando e coltivando prima le cellule precursori neurali della zona subependimale del topo adulto. Il passaggio successivo consiste nel preparare le camere Galvan Axxis e trasferire le cellule precursori neurali sulle camere.

L'ultimo passaggio consiste nell'applicare un campo elettrico a corrente continua attraverso la camera Galvan Axxis ed eseguire un'acquisizione con microscopia a intervalli per osservare la migrazione dei precursori neuronali. In definitiva, la microscopia a intervalli cattura le proprietà galvanotattiche dei precursori neuronali nei loro stati differenziato e indifferenziato. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul galvanotassi delle cellule precursori neuronali, può essere applicato anche ad altri sistemi, come un modello di ictus murino per il reclutamento dei precursori neuronali verso siti di lesione al fine di potenziare la riparazione neuronale.

La procedura sarà dimostrata da Rob Pilley Post, uno studente laureato del mio laboratorio. Quando si inizia questa procedura, le NPC devono essere state in coltura per sette giorni, in modo che le neurosfere primarie libere siano pronte per essere raccolte. Se necessario, iniziare a preparare tre camere Galvan Axxis posizionando tre vetrini quadrati.

Numero uno, coprire i vetrini con una bottiglia di acido cloridrico normale 6 per tutta la notte. La mattina seguente, preparare il gel matra per scongelarlo lentamente sul ghiaccio. Dopo quattro ore, sarà pronto per essere utilizzato nella costruzione della camera.

Per prima cosa, utilizzare un taglierino per vetro con punta a diamante per tagliare sei strisce rettangolari di vetro da nuovi vetrini quadrati numero uno. Trasferire i vetrini quadrati e le strisce rettangolari lavati con acido all'interno di una cappa a flusso laminare.

Lavare le strisce di vetro con etanolo al 70%, seguito da acqua per colture cellulari sterilizzata in autoclave. Lasciarle asciugare all'aria o asciugarle su carta senza lanugine. Successivamente, applicare grasso da vuoto sul perimetro di una superficie di ciascun vetrino quadrato e sigillarli alla base di una plastica da 60 millimetri.

Piastre di Petri. Applicare grasso da vuoto su un lato delle strisce di vetro rettangolari e sigillarle ai bordi opposti del quadrato. Vetrini per creare quadrati con una scanalatura centrale al centro di ogni piastra.

Sterilizzare questi quadrati di vetro modificati o camere con raggi UV per almeno 15 minuti in cappa. Successivamente, pipettare da 250 a 300 microlitri di poliolisina nella scanalatura centrale delle camere. Quindi incubare le camere a temperatura ambiente per due ore, circa 15 minuti prima della fine dell'incubazione.

Preparare la soluzione di matrigel dopo due ore, aspirare la lisina poliol e lavare le scanalature centrali con un millilitro di acqua autoclavata. Quindi pipettare da 250 a 300 microlitri di soluzione di matrigel sulle scanalature centrali e incubare le camere a 37 gradi Celsius per un'ora. Al termine dell'incubazione, aspirare la soluzione di matrigel.

Quindi lavare delicatamente le scanalature centrali con uno o due millilitri di SFM. Ora pipettare 100 microlitri di E-F-H-S-F-M o F-B-S-S-F-M sulle scanalature centrali in preparazione per le cellule coltivate. Successivamente, pipettare quattro o cinque millilitri della coltura contenente neurosfere in una nuova piastra di Petri da 60 millimetri.

Quindi posizionare la piastra di Petri sul portapreparati del microscopio per il conteggio, sotto l'obiettivo di ingrandimento 5x. Utilizzare una pipetta P10 per trasferire delicatamente da cinque a otto neurosfere intere nella scanalatura centrale di ogni camera. Fino a quattro.

Le neurosfere possono essere trasferite immediatamente, ma non dissociarle insieme alle neurosfere nei solchi centrali. Distribuirle con attenzione senza alterare il substrato di matrigel. Quindi aggiungere ulteriori 150 microlitri di E-F-H-S-F-M o F-B-S-S-F-M nei solchi centrali.

Ora coltivare le cellule in un incubatore umidificato. Dopo 17-20 ore di coltura, le NPC indifferenziate saranno disponibili dopo 69-72 ore. In coltura, saranno disponibili le NPC differenziate.

Sotto il microscopio invertito, selezionare la camera con le migliori cellule per l'analisi della migrazione mediante imaging di cellule vive. Le cellule devono essere rotonde, quasi completamente dissociate dai loro neurosfere, e non devono ancora aver formato, o aver appena iniziato a formare, prolungamenti in ambiente sterile. Preparare un coperchio per la camera.

Lavare un'oggettiva quadrata in vetro con etanolo al 70%, quindi con acqua autoclavata e applicare una striscia di grasso da vuoto su due bordi paralleli. Ora coprire la camera. Prima aspirare il mezzo di coltura dalla scanalatura centrale, quindi sigillare rapidamente l'oggettiva, facendola scivolare sulle pareti rettangolari come un tetto.

Successivamente, utilizzando l'azione capillare, caricare 100 microlitri di mezzo fresco nella scanalatura centrale. Ora utilizzare grasso da vuoto per creare dei confini per le pozzette di mezzo di coltura. A ciascuna estremità della scanalatura centrale del sistema di imaging di cellule vive, preparare dei tubi in gel di agarosio, elettrodi in argento e cloruro di argento e due piastre di Petri da 60 millimetri da utilizzare.

Come serbatoi di mezzo di coltura, lasciare le camere a riposo nell'ambiente a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 20-30 minuti. Durante questo periodo, preparare i coperchi delle due piastre di Petri vuote e il coperchio della piastra di Petri della camera Galvan Axxis praticando dei fori con un Dremel o una pipetta per strumenti, aggiungere da 1,5 a 2 millilitri di mezzo su ciascun lato del solco centrale e aggiungere da 7 a 8 millilitri di mezzo senza siero (SFM) in ciascuna piastra di Petri vuota. Posizionare una piastra di Petri su ciascun lato del solco centrale della camera e inserire un elettrodo in ciascuna piastra.

Collegare la camera alle piastre di Petri per stabilire la continuità elettrica. Mediante ponti di gel Agros, collegare gli elettrodi a un alimentatore esterno con un misuratore M in serie per misurare la corrente elettrica e accendere l'alimentatore. Utilizzare un voltmetro per misurare direttamente l'intensità del campo elettrico attraverso la scanalatura centrale.

Regolare l'uscita dell'alimentatore secondo necessità. Avviare ora il modulo time-lapse sul sistema di imaging. Nel software Axio vision selezionare l'acquisizione multidimensionale e fare clic su vedi.

Per i canali, selezionare il canale sei, fare clic su T per l'acquisizione temporizzata. Impostare l'intervallo di acquisizione temporizzata a un minuto, impostare la durata a otto ore nei campi delle impostazioni prima e dopo il punto temporale, selezionare il punto temporale prima e dopo. A questo punto, fare clic su Avvia e lasciare che l'esperimento prosegua per il tempo desiderato; al termine del saggio, procedere con l'analisi IHC.

L'analisi cinematica ha rivelato che in presenza di un DCEF di 250 millivolt per millimetro, gli NPC non differenziati mostrano un marcato e rapido movimento galvanotattico verso il catodo a questa intensità di campo: oltre il 98% degli NPC non differenziati ha migrato per l'intero periodo di sei-otto ore in cui sono stati osservati. In assenza di DCEF, è stato osservato un movimento casuale delle cellule.

Poiché le cellule morte non migrano, questo suggerisce che rimangono vitali durante questo periodo. In assenza o presenza di A-D-C-E-F, i fenotipi differenziati hanno subito una migrazione trascurabile, sia in presenza che in assenza di sottoinsiemi di cellule differenziate A-D-C-E-F. Si osservavano prolungamenti estesi che tendevano ad allinearsi perpendicolarmente alla direzione del DCEF, ma non si notava alcuna traslocazione evidente del corpo cellulare.

L'immunomarcatura ha confermato che le NPC mantenevano un'espressione positiva del marcatore delle precursori neurali nestin dopo sei ore di esposizione al campo elettrico in corrente continua. Nei saggi in cui le NPC sono state indotte a differenziarsi in fenotipi maturi, la maggior parte delle cellule esprime il marcatore dell'astrocita matura proteina acida fibrillare gliale o GFAP dopo sei ore di esposizione al campo elettrico in corrente continua. Seguendo questa procedura, è possibile ottenere informazioni sui meccanismi cellulari coinvolti nella trasduzione del campo elettrico in corrente continua in motilità cellulare, utilizzando modelli con knockout genetico.

O signore, un per esempio.