Analisi della migrazione cresta neurale e la differenziazione delle specie da Cross-trapianto

L'obiettivo generale di questa procedura è trapiantare un espianato del tubo neurale dorsale proveniente da un embrione di quaglia in un embrione di pollo in stadio corrispondente, al fine di tracciare la migrazione e il destino delle cellule della cresta neurale. Questo viene ottenuto innanzitutto strappando un piccolo foro nella membrana IGN dell'embrione di pollo ospite per accedere al tubo neurale. L'embrione di quaglia donatore viene quindi rimosso dal suo uovo per prepararlo all'escissione del trapianto.

Nel passaggio successivo, la regione di interesse viene escissa dal tubo neurale dell'embrione ospite. Una regione simile viene quindi escissa dal tubo neurale del donatore per il trapianto. Successivamente, il tubo neurale del donatore viene trapiantato nel tubo neurale dell'ospite.

Infine, l'embrione chimerico viene incubato fino allo stadio desiderato per la rilevazione delle cellule della cresta neurale giunte nell'organo di interesse. In definitiva, la migrazione e la differenziazione delle cellule della cresta neurale provenienti dal donatore in diverse posizioni nell'embrione ospite possono essere visualizzate mediante microscopia a immunofluorescenza. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i passaggi di microdissezione e innesto richiedono abilità motorie molto fini, rendendoli difficili da apprendere.

Cominciare lavando eventuali detriti dalle uova di pulcino con acqua tiepida. Disporre le uova in posizione orizzontale su un vassoio e quindi segnare con una matita i lati rivolti verso l'alto, per indicare la regione in cui sarà localizzato l'embrione. Per la preparazione X ovo degli embrioni donatori, incubare le zampe di quaglia con il lato ottuso.

Successivamente, posizionare le uova in un incubatore umidificato a 38 gradi Celsius e attivare la funzione oscillante. Una volta terminate le uova, sterilizzare le sommità spruzzandole con etanolo al 70% e quindi asciugandole rapidamente con un fazzoletto di carta Kim. Per evitare qualsiasi assorbimento attraverso il guscio dell'uovo, posizionare ogni uovo sterilizzato su un supporto individuale per uova, simile alla piastra di Petri foderata con fazzoletti di carta Kim piegati mostrata qui. Quindi, utilizzando pinzette AA sterili, praticare un piccolo foro sulla superficie superiore del guscio dell'uovo all'estremità appuntita dell'uovo.

Equipaggiare una siringa da cinque millilitri con un ago ipodermico da 18 e mezzo. Quindi, con il bisellino rivolto verso l'estremità appuntita dell'uovo, inserire verticalmente l'ago nel foro nel guscio dell'uovo. Per evitare danni accidentali al tuorlo causati dall'aspirazione, pulire il foro con etanolo al 70% come in precedenza e sigillare il foro con nastro adesivo trasparente.

Quindi, con la pinzetta a doppia A, praticare un altro foro sulla superficie superiore marcata del segmento orizzontale, non proprio all'apice. Successivamente, inserire un'estremità della pinzetta curva per iride nel foro in modo parallelo all'uovo. Stringere quindi la conchiglia esercitando una pressione verso il basso e muovendosi con un movimento circolare.

Rompere un foro, di due centimetri di diametro, nel guscio dell'uovo di pollo, scartando il frammento di guscio rimosso. L'embrione dovrebbe apparire come un disco opaco sulla sommità del tuorlo. Scartare tutti gli ovuli non fecondati identificati da un piccolo punto bianco sulla superficie del tuorlo o dall'assenza del blastoderma.

Ora, indossando un'adeguata protezione oculare, piegare un ago ipodermico da 26 e mezzo a un angolo di 45 gradi a partire dalla base dell'ago. Dopo aver fissato l'ago piegato con il becco rivolto verso l'alto a una siringa da un millilitro, riempire l'ago con inchiostro di India diluito. Pungere la membrana del tuorlo al di fuori del perimetro del blaster e far scivolare la punta dell'ago al di sotto dell'embrione, vicino alla superficie del tuorlo, ma senza penetrare negli strati embrionali.

Quindi iniettare una quantità appena sufficiente di inchiostro per delineare l'embrione, evitando di introdurre bolle d'aria. Estrarre con attenzione l'ago. A questo punto, utilizzando un microscopio stereoscopico e una sorgente luminosa con un carico termico limitato, come la lampada a collo d'oca in fibra ottica mostrata qui.

Stadiare gli embrioni secondo Hamburger e Hamilton. Registrare lo stadio sui gusci delle uova. Quindi applicare due o tre gocce di soluzione fisiologica sterile tiepida sulla superficie degli embrioni per prevenire la disidratazione e la contaminazione.

Quindi stendere un film di para sulla superficie delle uova per sigillare temporaneamente le finestre. Successivamente, preparare le uova di quaglia per il trapianto. Prima di rimuovere le uova dall'incubatrice, riempire una piastra di Petri con soluzione di Ringer.

Quindi aprire le uova sul lato arrotondato con pinze curve per esporre l'embrione. Utilizzando forbici da dissezione, effettuare quattro tagli a forma di quadrato attraverso la membrana corioallantoinica e il derma esterno all'embrione, assicurandosi che tutti i tagli si congiungano. Successivamente, utilizzando pinze da iride curve, afferrare delicatamente un lembo tagliato e sollevare l'embrione dall'uovo, trasferendolo nella piastra di Petri preparata.

Infine, rimuovere delicatamente la membrana vitellina con pinze di tipo n. 5, quindi stadiare gli embrioni al microscopio stereoscopico. Rimuovere il film di parafilm dall'embrione di pollo ospite. Quindi, utilizzando un ago di tungsteno affilato, praticare un piccolo foro nella membrana VII nella regione desiderata del tubo neurale.

Aggiungere una goccia di soluzione di Ringer all'embrione. Successivamente, per innesti unilaterali, come quello eseguito in questo video, utilizzare un ago di vetro modellato per effettuare con attenzione incisioni trasversali rostrali e caudali nella regione del mesencefalo del tubo neurale, senza oltrepassare la sua cavità. Quindi effettuare tagli bilaterali tra il tubo neurale dorsale e il mesoderma parietale.

Infine, separare con attenzione l'ectoderma espiantato dal tubo neurale, quindi rimuoverlo dall'embrione aspirandolo in una micropipetta di vetro. Utilizzare innanzitutto un embrione di quaglia con stadio corrispondente. Quindi espiantare una regione del tubo neurale di dimensioni simili a quella appena mostrata e aspirare l'ectoderma donatore X in una micropipetta di vetro contenente soluzione di Ringer.

Trasferire l'espianto X accanto alla regione escissa dell'ospite pollo. Quindi, utilizzando un ago di vetro tirato, orientare delicatamente l'espianto guidandolo nella regione ablata. Aggiungere con attenzione alcune gocce di soluzione di Ringer all'embrione per prevenire la disidratazione.

Infine, sigillare la finestra con del nastro adesivo da imballaggio, assicurandosi che il nastro sigilli l'intera regione dell'uovo con finestra, quindi riposizionare l'uovo nell'incubatrice fino allo stadio desiderato, disattivando la funzione di oscillazione durante l'incubazione del kyira; l'uovo può essere delicatamente ruotato a mano due volte al giorno per aumentarne la vitalità. Se si mira a stadi successivi dello sviluppo, questa immagine rappresentativa della regione innestata del tubo neurale dopo sei ore di reincubazione fino allo stadio HH 11 mostra l'incorporazione attesa del tessuto donatore di quaglia innestato nel tubo neurale del pollo ospite. Questa sezione trasversale della regione innestata allo stadio HH 11 mostra cellule della cresta neurale marcate con hnk, di cui una sta migrando lateralmente dal tubo neurale.

Le cellule di quaglia che contribuiscono al flusso migratorio delle cellule della cresta neurale e al tubo neurale sono chiaramente etichettate con QCPN. In stadi successivi, le cellule derivate dalle cellule della cresta neurale di quaglia possono essere tracciate fino ai loro tessuti finali di destinazione. Come si può osservare in questa figura, le cellule marcate con QCPN sono disseminate all'interno del mesenchima dell'embrione di pollo del processo mascellare. A E5, l'anticorpo QCPN può essere facilmente associato ad altri anticorpi per esaminare la differenziazione delle cellule della cresta neurale derivate dalla quaglia.

Nell'ambiente dell'ospite. Come mostrato qui, i neuroni sensoriali trigeminali derivati da cellule della cresta neurale di quaglia sono marcati dagli anticorpi QCPN e T UJ one. Dopo questa procedura, altri metodi come l'immunohistochimica e l'ibridazione in situ possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, ad esempio quali tessuti derivano dalle cellule della cresta neurale e quali geni esprimono le cellule della cresta neurale mentre si differenziano in vari tessuti.